中國東北地區(qū)HPV16型甲基化水平與宮頸病變程度關(guān)系的研究.pdf

1、目的:
　　宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤，高危亞型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續(xù)性感染是引起宮頸癌(cervical cancer，CC)發(fā)生的重要因素。與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的人乳頭瘤病毒高危亞型中有HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73和82，其中HPV16是最常見的與宮頸癌相關(guān)的型別。研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象在癌癥的發(fā)生過程中起著重要的作用，幾乎所

2、有的癌癥類型均發(fā)生異常的甲基化狀況。本研究應(yīng)用亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測臨床樣本中HPV16病毒L1基因的3個(gè)位點(diǎn)(7089，7134，7143)和長調(diào)控區(qū)(Long Control Region，LCR)15個(gè)位點(diǎn)(7268,7426,7452,7458,7532,7550,7673,7679，7691，7859，31，37，43，52，58)的甲基化水平，分析病毒DNA甲基化水平

3、與宮頸病變發(fā)生的關(guān)系，進(jìn)而為臨床上宮頸病變的診斷和治療提供新的依據(jù)。
　　方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、收集2014年4月至2015年5月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院就診的女性患者宮頸拭子標(biāo)本122例，所收集的標(biāo)本全部為HPV16陽性，并具有盛京醫(yī)院病理科的病理診斷，其中正常和鱗狀上皮內(nèi)低度病變(Normal/Low-gradeintraepithelial lesions，Normal/LSIL)組42例，鱗狀上皮

4、內(nèi)高度病變(High-gradeintraepithelial lesion，HSIL)組40例，宮頸癌(Cervical cancer，CC)組40例。
　　2、DNA提取試劑盒:QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Valentia，CA)。
　　3、甲基化重亞硫酸鹽處理試劑盒:EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZymoReasearch,Irivine,CA,USA)。
　　

5、4、PCR相關(guān)試劑及TA克隆試劑盒。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、使用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)從富頸拭子標(biāo)本中提取DNA。以提取的DNA為模板，分別對L1及5'-LCR區(qū)、Enhancer區(qū)及Promoter區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　2、將擴(kuò)增成功的DNA使用甲基化重亞硫酸鹽處理試劑盒(EZ DNAMethylation-Gold Kit)進(jìn)行處理，處理后的DNA作為模板用BSP引物分別對

6、3'-L1/5'-LCR區(qū)、Enhancer區(qū)及3'-LCR區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　3、用BSP引物擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物，過柱純化后進(jìn)行TA克隆。每個(gè)標(biāo)本用PCR方法隨機(jī)挑取5個(gè)陽性克隆進(jìn)行目的片段的測序，用BioEdit生物信息學(xué)軟件分析測序結(jié)果，從而確定目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀況。
　　4、使用SPSS13.0卡方雙側(cè)檢驗(yàn)和圖表的方法分析數(shù)據(jù)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;用ROC曲線計(jì)算位點(diǎn)甲基化率檢測不同宮頸

7、病變程度的臨界值，并同時(shí)計(jì)算靈敏度、特異度和曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)。
　　結(jié)果:
　　1、本實(shí)驗(yàn)研究的122例臨床樣本中，3'-L1/5'-LCR基因片段有30個(gè)Normal/LSIL樣本、35個(gè)HSIL樣本及35個(gè)CC樣本測序成功。在增強(qiáng)子區(qū)域有30個(gè)Normal/LSIL樣本、31個(gè)HSIL樣本及30個(gè)CC樣本測序成功。在啟動(dòng)子區(qū)域有37個(gè)Normal/LSIL樣本、35個(gè)HSIL

8、樣本及37個(gè)CC樣本測序成功。
　　2、本研究的整個(gè)基因區(qū)域有18個(gè)CpG位點(diǎn)。在18個(gè)CpG位點(diǎn)中所有樣本的平均樣本甲基化率是25.04％（1809個(gè)CpGs中453個(gè)CpGs發(fā)生甲基化）。每個(gè)位點(diǎn)的平均樣本甲基化率最低為5.49％，最高為51％。3'-L1和啟動(dòng)子區(qū)的甲基化位點(diǎn)的平均樣本甲基化率高于5'-L1和增強(qiáng)子區(qū)的甲基化位點(diǎn)的平均樣本甲基化率。
　　3、CpG位點(diǎn)7089,7134,7143,7268,7426,7

9、452,7458,7673,31,37,43,52，and58在CC中的樣本甲基化率最高，其次是HSIL中，在Normal/LSIL中樣本甲基化率最低(P＜0.05)。位于復(fù)制起點(diǎn)的CpG7859在Normal/LSIL和CC中的樣本甲基化率分別是2.70％和24.32％，在HSIL中沒有樣本在該位點(diǎn)發(fā)生甲基化。在CpG位點(diǎn)7089和7143處，Normal/LSIL組和HSIL組、Normal/LSIL組和CC組、以及HSIL組和CC

10、組的樣本甲基化率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、ROC曲線用于分析CpG位點(diǎn)7089和7143的樣本甲基化率與宮頸病變之間的關(guān)系。CpG位點(diǎn)7089、7143分別用于區(qū)分CC組和Normal/LSIL、HSIL組，CC、HSIL組和Normal/LSIL組，CC組和HSIL組時(shí)的AUC值低于這兩個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合后的AUC值。
　　結(jié)論:
　　HPV16型基因在3'-L1/LCR區(qū)的甲基化水平與中國東北部地區(qū)婦女的宮頸病變程度存在