APC基因甲基化與人宮頸癌細胞增殖及凋亡相關性研究.pdf

1、目的：檢測人宮頸癌細胞系HeLa（HPV18型）、CaSki和SiHa（HPV16型）中結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因5'端啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探索APC基因表達沉默是否與其啟動子區(qū)CpG島甲基化有關，觀察肼苯噠嗪(Hydralazine)能否作為去甲基化藥物誘導APC基因表達，并進一步探討肼苯噠嗪對宮頸癌細胞的生長抑制作用，為宮頸癌的診斷及去甲基化治療提供新的實驗依據(jù)。 方法：(1)利用甲基化特異性PCR（Methyl

2、ation specific PCR, MSP）檢測人宮頸癌細胞系HeLa、CaSki和SiHa中APC基因5'端啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。(2)不同濃度肼苯噠嗪處理上述三種宮頸癌細胞及正常細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞HECV，MTT法檢測各組細胞生長情況。(3)MSP法檢測肼苯噠嗪處理后HeLa和CaSki細胞中APC基因5'端啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)；反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）及熒光定量PCR（FQ-PCR）法檢測肼苯噠嗪對APC m

3、RNA表達的影響；(4)流式細胞術(shù)檢測肼苯噠嗪對細胞周期和細胞凋亡的影響，免疫組化SP法檢測肼苯噠嗪對APC相關蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin,β-cat）表達的影響。 結(jié)果：(1)MSP檢測結(jié)果表明HeLa細胞系APC基因5'端啟動子區(qū)存在CpG島甲基化，CaSki細胞系APC基因為半甲基化，SiHa細胞系APC基因無甲基化。(2) 5、10、20、40、80、160和320 μmol/L 肼苯噠嗪分別處理三種宮頸癌細胞

4、系及正常細胞HECV，MTT法檢測到20 μmol/L以上肼苯噠嗪處理72 h后，三種宮頸癌細胞系的生長均可被抑制，且抑制率隨時間及藥物濃度的增加而逐漸升高；當40 μmol/L肼苯噠嗪處理72 h后，HeLa、CaSki和SiHa細胞系的生長抑制率分別為(52.12±3.78) ％、(44.31±2.59) ％、(47.73±4.73) ％，而同樣情況下，正常細胞HECV表現(xiàn)為耐藥，抑制率只有(27.18±0.79) ％。 (3) M

5、SP法檢測40 μmol/L肼苯噠嗪處理后HeLa和CaSki細胞中APC基因甲基化狀況，發(fā)現(xiàn)APC基因啟動子呈去甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)APC mRNA在HeLa和CaSki細胞中均呈陽性表達，F(xiàn)Q-PCR法觀察到肼苯噠嗪處理HeLa、CaSki和SiHa三種細胞后，APC mRNA表達分別是處理前的10.35倍、11.40倍及0.73倍。（4）流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)：40 μmol/L 肼苯噠嗪作用HeLa、CaSki細胞72

6、h后，細胞周期的G0/G1期均顯著減少，細胞被阻滯于S期和G2/M期，且凋亡率與對照組比較均顯著增多（P<0.01）；SP法檢測到40 μmol/L肼苯噠嗪處理HeLa和CaSki細胞72 h后，β-cat蛋白可恢復在細胞膜上的表達。 結(jié)論：(1)兩種不同HPV型別的 HeLa和CaSki細胞中APC基因5'端啟動子區(qū)均存在CpG島甲基化，APC基因甲基化在人宮頸癌癌變過程中可能是一種比較重要的分子調(diào)控機制。和CaSki同為HP

7、V16型的SiHa細胞中APC基因5'端啟動子區(qū)無CpG島甲基化，表明人宮頸癌細胞的HPV型別和APC基因5'端啟動子區(qū)CpG島是否甲基化無相關性。(2)肼苯噠嗪能作為去甲基化藥物誘導因啟動子區(qū)CpG島甲基化而表達沉默或減少的APC基因表達呈陽性或者表達增強。(3)肼苯噠嗪抑制宮頸癌細胞系生長的機制不是單一的使APC 基因去甲基化。(4)肼苯噠嗪抑制宮頸癌細胞系生長的主要原因是將細胞阻滯于S期和G2/M期，同時使凋亡增多。(5)肼苯噠嗪