宮頸癌相關(guān)基因DNA甲基化與遺傳分析及臨床應(yīng)用研究.pdf

1、宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在乳腺癌之后，居第二位。全世界每年約有50萬(wàn)左右的宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5％。在我國(guó)隨著醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，宮頸癌死亡率得到了控制，但發(fā)生率一直居高不下，且有發(fā)病年輕化的趨勢(shì)，因此對(duì)宮頸癌發(fā)生機(jī)理及新的診療方法的研究一直是腫瘤學(xué)家研究的熱點(diǎn)。 宮頸癌的發(fā)生與人們行為因素具有一定關(guān)系，但在不同種族、不同地區(qū)發(fā)病特點(diǎn)不同。本研究通過(guò)對(duì)151例宮頸癌患者的病歷資料進(jìn)行系統(tǒng)完整分析，發(fā)

2、現(xiàn)在我國(guó)宮頸癌多發(fā)于中老年婦女，但年輕患者發(fā)病率也很高，占12.58％，且年輕患者中94.74％達(dá)到中晚期，說(shuō)明年輕患者發(fā)病后進(jìn)展迅速，惡性程度高，所以對(duì)宮頸癌的篩查干預(yù)應(yīng)提前到35歲以前。同時(shí)本文還對(duì)宮頸癌患者發(fā)病規(guī)律進(jìn)行了分析，結(jié)果表明與對(duì)照組相比初次性交年齡早、性伴侶多、吸煙、酗酒等都是宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，此外有上皮性腫瘤家族史和毒物接觸史的人患宮頸癌的幾率明顯加大，因此對(duì)這些高危人群定時(shí)體檢、篩查是預(yù)防宮頸癌的重要措施。

3、 宮頸癌的發(fā)生是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中HPV病毒感染與宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)。為了了解我國(guó)宮頸癌病人的HPV感染特點(diǎn)，本研究采用敏感性高、特異性強(qiáng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了151例宮頸癌患者的HPV感染情況，發(fā)現(xiàn)HPV定量檢測(cè)均達(dá)到陽(yáng)性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，感染陽(yáng)性率高達(dá)100％；與國(guó)內(nèi)外其它研究小組報(bào)道不同，都是高危型：HPV混合感染，且以HPV18為主要感染類(lèi)型的最多，達(dá)到39.74％，同時(shí)發(fā)現(xiàn)以HPV 33感染為主的病例也

4、達(dá)到24.50％，高于文獻(xiàn)報(bào)道的3％左右，以HPV 33為主要感染類(lèi)型的患者臨床分期和組織學(xué)分級(jí)都高，說(shuō)明：HPV 33感染與宮頸癌惡性度有關(guān)，HPV 33感染增多可能是我國(guó)宮頸癌HPV感染的新特點(diǎn)。 抑癌基因失活在細(xì)胞癌變中發(fā)揮重要作用。FHIT基因是一種抑癌基因，位于3p14.2，被認(rèn)為具有HPV病毒的整合位點(diǎn)。FHTT基因與宮頸癌的關(guān)系以及作用機(jī)制目前尚無(wú)定論。本研究利用生物信息學(xué)方法獲得FHIT基因外顯子5～10及附近內(nèi)

5、含子序列，并依此設(shè)計(jì)引物，采用降式PCR檢測(cè)外顯子5～10的缺失情況，發(fā)現(xiàn)患者血漿中外顯子5缺失發(fā)生率為22.52％(34/151)，外顯子6缺失發(fā)生率為19.87％(30/151)，外顯子7缺失發(fā)生率為13.25％(20/151)，外顯子8缺失發(fā)生率為14.57％(22/151)，外顯子9缺失發(fā)生率為11.26％(17/151)，外顯子10缺失發(fā)生率為6.62％(10/151)，與對(duì)應(yīng)宮頸癌組織中檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果一致。將FHIT基因外顯

6、子缺失情況與FHIT蛋白表達(dá)情況對(duì)應(yīng)起來(lái)發(fā)現(xiàn)FHIT基因外顯子5、6缺失與FHTT蛋白表達(dá)減弱或缺失具有重要關(guān)系，只有1例外顯子7缺失病例出現(xiàn)FHIT蛋白表達(dá)減弱。本研究雖然外顯子8～10缺失的病例沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的FHIT蛋白表達(dá)改變，但只有宮頸癌患者發(fā)現(xiàn)有它們的缺失，所以外顯子8～10缺失與宮頸癌也具有一定相關(guān)性，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究?？傊?，F(xiàn)HIT基因外顯子缺失是FHIT基因失活，以至宮頸癌發(fā)生的重要遺傳機(jī)制。抑癌基因失活

7、既可以通過(guò)遺傳學(xué)途徑，也可以通過(guò)基因甲基化等表觀遺傳學(xué)途徑。國(guó)外有關(guān)于宮頸癌患者FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的報(bào)道，但檢出率較低為32％左右，所以不能廣泛應(yīng)用于臨床。本研究針對(duì)國(guó)內(nèi)外研究方法的缺點(diǎn)，利用生物信息學(xué)方法，設(shè)計(jì)了甲基化特異性引物，并對(duì)亞硫酸氫鈉修飾后的DNA濃度進(jìn)行定量，提高了MSP的診斷正確率。通過(guò)對(duì)FHIT基因5'端啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀況分析，發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者組織中存在FHIT基因高甲基化的現(xiàn)象，檢出率高達(dá)53.33

8、％，這為以甲基化為指標(biāo)診斷宮頸癌提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 關(guān)于FHIT基因甲基化在宮頸癌發(fā)生中是早期事件，還是晚期事件，目前在國(guó)際上還存在著爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn)在臨床Ⅰ期和G1級(jí)的患者中都有FHIT基因甲基化出現(xiàn)，隨著臨床分期與組織學(xué)分級(jí)的增加，F(xiàn)HIT基因甲基化發(fā)生的陽(yáng)性率也在逐漸增加，并與FHIT蛋白表達(dá)的減弱或缺失有關(guān)，說(shuō)明FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在宮頸癌的發(fā)生中屬于早期事件，支持了Wistuba和Butler等人的觀點(diǎn)。同時(shí)

9、說(shuō)明FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)是引起宮頸癌發(fā)生的表觀遺傳學(xué)因素，它與FHIT基因外顯子缺失引起宮頸癌是兩種獨(dú)立的機(jī)制，但兩者有可能協(xié)同起作用。 CDHl基因編碼產(chǎn)物E-鈣黏素(E-CAD)是重要的細(xì)胞與細(xì)胞間黏附分子，CDH1基因失活被認(rèn)為與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為檢測(cè)腫瘤侵襲能力的指標(biāo)。本研究檢測(cè)了宮頸癌患者CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，并與臨床分期和組織學(xué)分級(jí)對(duì)應(yīng)起來(lái)，發(fā)現(xiàn)隨臨床分期與組織學(xué)分級(jí)的增加，C

10、DH1甲基化的檢出率也逐漸增加，CDH1基因甲基化狀態(tài)可以成為評(píng)估宮頸癌進(jìn)展、治療效果以及預(yù)后的指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞可以釋放DNA進(jìn)入患者的血漿/血清中，檢測(cè)患者血漿/血清中腫瘤DNA的狀態(tài)可作為無(wú)創(chuàng)傷性檢測(cè)腫瘤的指標(biāo)。目前對(duì)于宮頸癌患者血漿中FHIT基因甲基化狀態(tài)尚無(wú)報(bào)道。本研究在國(guó)際上首次采用MSP的方法分別對(duì)血漿和組織中FHIT基因和CDH1基因的5’端啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀況進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)血漿與組織的符合率在FHIT基因?yàn)?0