宮頸癌RASSFIA基因啟動(dòng)子與第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的發(fā)現(xiàn)使得宮頸癌成為迄今病因最明確的一種癌癥，HPV感染干擾經(jīng)典抑癌基因p53及RB的作用也已確認(rèn)。HPV也可能通過(guò)誘導(dǎo)某些抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化而引起該基因表達(dá)沉默參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，但是HPV如何誘導(dǎo)宿主基因甲基化以及作用于那些基因有待于深入研究。
　　目的探討4種宮頸癌細(xì)胞系及宮頸癌組織中RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)，明確甲基化

2、轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine，5-Aza-dc)對(duì)宮頸癌細(xì)胞系RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。
　　方法采用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)和基于亞硫酸氫鹽修飾的基因組測(cè)序法(Bisulfite genomic sequencing，BGS)檢測(cè)5-Aza-dc處理前后4種宮頸癌細(xì)胞系、宮頸癌組織以

3、及正常宮頸組織中RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)。同時(shí)應(yīng)用實(shí)施熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)RASSFIA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
　　結(jié)果①M(fèi)SP檢測(cè)RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)結(jié)果顯示2種HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系HeLa, Caski呈U型，2種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3，C-33A呈M型。經(jīng)5-Aza-dc處理后，HT-3，C-33A細(xì)胞系M+U型，而2種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系無(wú)

4、明顯變化。
　?、趯m頸癌組織和正常宮頸組織中RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的甲基化率分別為6％(3/48)和0％(0/15)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，宮頸癌組織RASSFIA基因啟動(dòng)子的甲基化率與正常宮頸組織比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FISH精確概率，P=0.2691);HPV陽(yáng)性宮頸癌組織和細(xì)胞系以及HPV陰性宮頸癌組織和細(xì)胞系中RASSFIA基因啟動(dòng)子與第1外顯子的甲基化率分別為2.17％(1/46)和66.7％(4/6)，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明

5、，兩者之間甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FISH精確概率，P=0.00027)。在HPV感染的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中未發(fā)現(xiàn)RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的甲基化。僅有1例HPV感染的宮頸腺癌中存在RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的甲基化。
　?、跙GS結(jié)果顯示RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的64個(gè)CpG位點(diǎn)基化狀態(tài)，2種HPV陽(yáng)性細(xì)胞系HeLa及Caski除個(gè)別位點(diǎn)發(fā)生甲基化外，其余位點(diǎn)均未發(fā)生甲基化;而2種HPV陰性

6、宮頸癌細(xì)胞系HT-3及C-33A則表現(xiàn)為幾乎所有位點(diǎn)的甲基化。兩種不同濃度5-Aza-dc作用于HT-3和C-33A細(xì)胞系后，其甲基化程度降低。1例HPV陽(yáng)性、1例HPV陰性宮頸腺癌組織及1例HPV陰性的宮頸鱗癌呈高甲基化狀態(tài)。
　?、莘讲罘治鲲@示，兩種不同濃度5-Aza-dc作用HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3及C-33A在后，RASSFIA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FHT-3=85.598，P=0.00; FC-33

7、A=12.476，P=0.00)。而在HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系Caski中，兩種不同濃度5-Aza-dc作用前后，RASSFIA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCaski=1.080,P=0.398)。
　?、迣m頸癌組織與正常宮頸組織中RASSFIA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(t=1.908，P=0.069); HPV陽(yáng)性和HPV陰性宮頸癌組織中RASSFIA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.085，P=0.756)

8、。
　　結(jié)論①HPV陽(yáng)性和HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系中RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)不同。
　?、赗ASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的高甲基化可抑制該基因表達(dá);5-Aza-dc處理可使RASSF1A基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)去甲基化，重新激活基因的表達(dá)。
　?、蹆H少數(shù)宮頸癌組織中RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的高甲基化，在HPV感染的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中未發(fā)現(xiàn)RASSFIA基因啟動(dòng)子及第1外顯子區(qū)的