宮頸癌SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、持續(xù)高危型人乳頭瘤病毒的感染已被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致宮頸癌的主要病因，HPV感染后會引起遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)的改變，DNA甲基化是宮頸癌發(fā)生過程中重要的表觀遺傳學(xué)機制。
　　目的：探討宮頸癌細(xì)胞系及宮頸癌組織中SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)及其對表達的影響，并分析SPINT2基因甲基化與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法：選取HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、SiHa，HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3、C-

2、33A及50例宮頸癌組織、20例正常宮頸組織作為研究對象。采用5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理HeLa細(xì)胞系，載有HPV16 E6/E7基因的慢病毒感染HT-3細(xì)胞系，并用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)以及亞硫酸氫鹽基因組測序法(Bisulfite genomic sequencing，BGS)檢測宮頸癌細(xì)胞系、宮頸組織、5-Aza-CdR處理后的HeLa細(xì)胞及慢病毒感染

3、后的HT-3細(xì)胞SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)，實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR)檢測其轉(zhuǎn)錄表達情況。
　　結(jié)果：①細(xì)胞系甲基化狀態(tài)：MSP結(jié)果顯示HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞系只出現(xiàn)M條帶，CaSki、SiHa細(xì)胞系出現(xiàn)M+U條帶，HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3、C-33A細(xì)胞系只出現(xiàn)U條帶，5-Aza-CdR處理后的HeLa細(xì)胞出現(xiàn)M+U條帶，慢病毒感染后的HT-3

4、細(xì)胞仍為U條帶。BGS結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞系甲基化率為95.1％，CaSki細(xì)胞系甲基化率為46.3%，SiHa細(xì)胞系甲基化率為32.1%，C-33A細(xì)胞系甲基化率為4.9%，而HT-3細(xì)胞系中未見甲基化位點，5-Aza-CdR處理后的HeLa細(xì)胞甲基化率降為56.0%，慢病毒感染后的HT-3細(xì)胞甲基化率為8.8%。②宮頸組織甲基化狀態(tài)：50例宮頸癌組織中SPINT2基因呈現(xiàn)出3種不同的甲基化狀態(tài)，其中M型有2例(2/50,4%)，M+

5、U型25例(25/50,50%)，U型23例(23/50,46%)。而20例正常宮頸組織中僅有5例出現(xiàn)M+U型(5/20,25%)，余15例均為U型(15/20,75%)。宮頸癌組織甲基化率高于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)。其中HPV陽性宮頸癌組織46例，其甲基化狀態(tài)為：M型有2例(2/46,4.35%)，M+U型25例(25/46,54.35%)，U型19例(23/46,50%)；4例HPV陰性宮頸癌組織均為U型

6、。HPV陽性宮頸癌組織甲基化率高于 HPV陰性宮頸癌組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038)。③SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化率與宮頸癌的分級有相關(guān)性(P=0.003)，其中G3的甲基化率高于G2，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，G1與G2、G1與G3之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而SPINT2的甲基化與年齡、分期、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、陰道累及情況均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。④三種HPV陽性細(xì)胞系中SP

7、INT2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達量較兩種HPV陰性細(xì)胞系表達量低，表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.027)。5-Aza-CdR處理前后HeLa細(xì)胞中SPINT2基因的轉(zhuǎn)錄表達存在顯著性差異，處理后為處理前的3.945倍，載有HPV16 E6/E7基因的慢病毒感染HT-3細(xì)胞后，SPINT2基因的轉(zhuǎn)錄表達量為感染前的0.688倍。⑤宮頸癌組織中mRNA的轉(zhuǎn)錄表達量低于正常宮頸組織，表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032)。⑥發(fā)生甲基化的宮頸組織m

8、RNA的轉(zhuǎn)錄表達量低于未發(fā)生甲基化的宮頸組織，表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。
　　結(jié)論：①SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)的甲基化率在宮頸癌中明顯高于正常宮頸組織。②HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系甲基化率高于HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系，HPV陽性宮頸癌組織甲基化率高于HPV陰性宮頸癌組織，表明SPINT2基因甲基化狀態(tài)可能與HPV的感染有關(guān)。③宮頸癌中SPINT2基因啟動子及第1外顯子區(qū)發(fā)生甲基化與其mRNA轉(zhuǎn)錄表達下調(diào)密切相關(guān)