宮頸癌患者Treg細(xì)胞及其Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的研究.pdf

1、近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞對(duì)于調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)、維持自身免疫耐受起到至關(guān)重要的作用，其負(fù)性免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及與眾多疾病特別是惡性腫瘤間關(guān)聯(lián)已經(jīng)被大量研究所證實(shí)。目前腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域普遍認(rèn)為，Treg細(xì)胞抑制了抗腫瘤免疫功能，促進(jìn)了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Treg是一個(gè)異質(zhì)性群體，大體可以分為兩個(gè)亞群，包括自然產(chǎn)生的Treg細(xì)胞(nTreg)和抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞(iTreg)，2種亞群在細(xì)胞起源、抗原特異性及調(diào)節(jié)免疫抑制等方面不盡相同，目

2、前認(rèn)為是iTreg細(xì)胞抑制了抗腫瘤免疫，而非nTreg細(xì)胞。由于nTreg和iTreg細(xì)胞沒(méi)有特異性的表型差異，因此目前尚無(wú)科學(xué)方法對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。一般認(rèn)為，在沒(méi)有受到抗原刺激的情況下，Treg細(xì)胞大多屬于nTreg，如果機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，體內(nèi)nTreg和iTreg則共存。因此，如果可以在腫瘤患者體內(nèi)特異性甄別iTreg細(xì)胞與nTreg細(xì)胞，靶向去除iTreg細(xì)胞或針對(duì)性抑制其功能，將為腫瘤免疫治療帶來(lái)希望。
　　Treg細(xì)胞免

3、疫抑制功能的發(fā)揮依賴(lài)于Foxp3分子的表達(dá)，F(xiàn)oxp3是轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix（叉頭樣/翼狀螺旋）家族的成員，其編碼基因位于X染色體，F(xiàn)oxp3分子是賦予Treg細(xì)胞免疫抑制功能的主要分子。研究發(fā)現(xiàn)，nTreg細(xì)胞Foxp3呈持續(xù)而穩(wěn)定的表達(dá)，其免疫抑制功能因此能夠穩(wěn)定發(fā)揮，而體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg，其Foxp3表達(dá)卻極不穩(wěn)定，可能需要體外培養(yǎng)環(huán)境中多種細(xì)胞因子，諸如TGF-β、IL-10、IL-2等的持續(xù)

4、刺激來(lái)維持其穩(wěn)定表達(dá)。相對(duì)于單純的體外研究環(huán)境，實(shí)際體內(nèi)免疫環(huán)境要復(fù)雜的多，究竟哪種因素或由幾種因素協(xié)同作用誘導(dǎo)iTreg分化，并進(jìn)一步調(diào)控Foxp3的表達(dá)卻不得而知。表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)Foxp3基因具有高度保守的非編碼區(qū)(conserved noncoding sequence，CNS)，包括啟動(dòng)子區(qū)及內(nèi)含增強(qiáng)子區(qū)，該區(qū)域富含CpG島，nTreg細(xì)胞CpG位點(diǎn)幾乎全部為去甲基化狀態(tài)，而體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg細(xì)胞該區(qū)域甲基化程度

5、增高。
　　目的：
　　眾所周知，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)過(guò)程，同時(shí)也是腫瘤免疫失衡的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程。Treg細(xì)胞在這一進(jìn)程中處于負(fù)性免疫調(diào)控的中心。我們推測(cè)，腫瘤患者體內(nèi)的Treg細(xì)胞，特別是iTreg細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)控可能起到關(guān)鍵作用。本課題組通過(guò)采集臨床資料，動(dòng)態(tài)研究宮頸癌患者Treg細(xì)胞Foxp3的表達(dá)變化及其啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平，深入了解腫瘤患者體內(nèi)Treg細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)，為今后的免疫靶向治療提供理

6、論依據(jù)。
　　材料及方法:
　　一、研究對(duì)象
　　本實(shí)驗(yàn)獲得解放軍202醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參加者均被告研究目的，并簽署知情同意書(shū)。簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣分組，隨機(jī)選取2013年1月至2014年6月間本院婦科病房收治的早期宮頸癌患者（FIGO分期為Ⅰa2～Ⅱa1期）25例，臨床分期Ⅰa2期5例，Ⅰb1期7例，1b2期8例，Ⅱa1期5例;組織學(xué)類(lèi)型鱗癌20例，腺癌4例，腺鱗癌1例。HSIL（high-grade squam

7、ous intereapithelial lesion，又稱(chēng)為宮頸鱗狀上皮內(nèi)高度病變）患者[1]20例，其中宮頸癌患者均采用廣泛性子宮切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)前未行放化療，如術(shù)后需輔助治療，均于術(shù)后一個(gè)月進(jìn)行;HSIL患者采用LEEP局部切除術(shù);同期內(nèi)收集我院行體檢的健康志愿者(TCT及HPV檢測(cè)均陰性)10例作為正常健康對(duì)照。上述患者和正常對(duì)照者平均年齡分別為43.8+4.4歲、44.1±5.0歲39.5±2.7歲，組間無(wú)顯著性差異

8、(P＜0.05)，所有研究對(duì)象無(wú)嚴(yán)重感染、結(jié)締組織病、自身免疫病、代謝病（糖尿病除外）和其他嚴(yán)重的慢性疾患（如晚期肝硬化、未經(jīng)治療的甲狀腺功能亢進(jìn)或減退等），近3個(gè)月未行免疫治療。
　　二、主要試劑與儀器
　　主要試劑:eBioscience公司Treg細(xì)胞流式檢測(cè)試劑盒（鼠抗人CD4-FITC、CD25-APC，F(xiàn)oxp3-PE單克隆抗體）及同型IgG熒光對(duì)照;美天旎公司人Treg磁珠分離試劑盒;ZYMO RESEARCH

9、公司DNA甲基化試劑盒;上海生工PCR引物;人TGF-β、IL-10 ELISA試劑盒等。
　　主要儀器:BD公司FACS CantoⅡ型流式細(xì)胞儀，PCR儀，RT-PCR儀，自動(dòng)測(cè)序儀，全自動(dòng)酶標(biāo)儀，電泳儀（槽），低速離心機(jī)，紫外凝膠成像系統(tǒng)等。
　　三、標(biāo)本采集與檢測(cè)方法
　　1、所有受試對(duì)象（除外健康自愿者）于術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)期抽取清晨空腹肘靜脈血8 ml，分別注入EDTA管6ml及非抗凝管2ml，立即置入冰盒送

10、解放軍202醫(yī)院優(yōu)生優(yōu)育實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
　　2、Ficoll密度梯度分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)
　　向2只無(wú)菌25ml離心管中加入5ml淋巴細(xì)胞分離液;將6ml EDTA抗凝靜脈血液與等量Hanks液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢滴加于分層液面上，注意保持清楚界面;2000rm離心20min，離心管內(nèi)分為三層，在上、中層界面處有一處單核細(xì)胞聚集的白色云霧狀窄帶;用毛細(xì)管插入此層中吸出單個(gè)核細(xì)胞;用5倍體積的Hanks洗滌液

11、，上下顛倒混勻，1500rm離心5min，棄上清，再重復(fù)洗滌、離心，最后加入10％胎牛血清RPMI1640，重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，添加Hanks平衡液使最終PMBC濃度達(dá)到1×107/ml。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞
　　按試劑盒說(shuō)明操作:取含1×106個(gè)新鮮人外周血PMBC懸液各100μl，分為4組:空白對(duì)照管、FITC標(biāo)記的CD4單抗單標(biāo)對(duì)照樣本管、PE標(biāo)記的CD25單抗單標(biāo)對(duì)照樣本

12、管、PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3單抗單標(biāo)對(duì)照樣本、三標(biāo)檢測(cè)管;加入300μl冷的流式染色緩沖液，充分吹打及4℃避光孵育;開(kāi)機(jī)，10min穩(wěn)定，以前向散射角(FSC)為橫坐標(biāo)、側(cè)向散射角(SSC)為縱坐標(biāo)的二維散點(diǎn)圖上，調(diào)整參數(shù)、閾值，排除碎片和噪聲干擾，以CD4設(shè)門(mén)，以CD4為橫坐標(biāo)，SSC為縱坐標(biāo)，淋巴細(xì)胞分為CD4+T細(xì)胞和CD4-T細(xì)胞，在CD4+T細(xì)胞中，以CD25設(shè)門(mén)，分析檢測(cè)CD4+CD25+ Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量及

13、所占CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例。
　　4、磁珠分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞。
　　5、采用ELISA試劑盒檢測(cè)TGF-β、IL-10的含量。
　　6、亞硫酸氫鈉修飾的甲基化測(cè)序技術(shù)(bisulfite sequencing PCR，BSP)對(duì)宮頸癌患者Treg細(xì)胞Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)進(jìn)行甲基化檢測(cè)及測(cè)序。
　　7、采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞內(nèi)甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的表達(dá)。<

14、br>　　結(jié)果:
　　1、宮頸癌及HSIL患者分別與對(duì)照組比較，外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T及CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細(xì)胞比例均呈顯著增加(P＜0.05);術(shù)后1周，CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例無(wú)明顯變化，而CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細(xì)胞比例卻出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05);術(shù)后1個(gè)月與術(shù)后1周比較，CD4+CD25+Treg/CD4+T比例出現(xiàn)了明顯

15、下降(P＜0.05)，而CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細(xì)胞比例較術(shù)后1周卻無(wú)明顯變化;HSIL與宮頸癌患者之間比較始終無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、Treg細(xì)胞相關(guān)免疫細(xì)胞因子TGF-β、IL-10在宮頸癌及HSIL患者血清中表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，術(shù)后1周及術(shù)后1月，其表達(dá)水平又出現(xiàn)顯著性降低(P＜0.05);其表達(dá)水平與外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量變化呈正相關(guān)(P＜

16、0.05);而與CD4+CD25+Treg細(xì)胞的數(shù)量變化卻未見(jiàn)明顯相關(guān)。
　　3、對(duì)宮頸癌及HSIL患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)(-204～+12bp)8個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行焦硫酸測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)（-138，-77，-65）CpG位點(diǎn)甲基化水平較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05); DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、DNMT3a) mRNA表達(dá)水平亦較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05);而術(shù)后

17、一個(gè)月，DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平呈顯著下降，較對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。宮頸癌和HSIL患者無(wú)論是在甲基化位點(diǎn)、表達(dá)水平，還是在甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平方面均無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1、宮頸癌及HSIL患者外周血Treg細(xì)胞Foxp3表達(dá)具有不穩(wěn)定性，其表達(dá)水平與抑制性細(xì)胞因子TGF-β、IL-10表達(dá)水平呈正相關(guān)，二者可能共同參與形成了宮頸腫瘤患者體內(nèi)的免疫抑制環(huán)境，為評(píng)估腫瘤患者的免疫狀態(tài)，臨床治療效果以及預(yù)后