PGRN與宮頸癌相關(guān)性及信號(hào)通路研究和RbAp48對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性研究.pdf

1、第一部分、PGRN與宮頸癌的相關(guān)性及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究
　　 宮頸癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌。2008年全球估計(jì)新發(fā)宮頸癌病例52.98萬，死亡病例25.51萬人，其中85％新發(fā)病例在發(fā)展中國家。在我國，每年新增的宮頸癌病人達(dá)15萬人左右，有大約2萬名婦女死于這種疾病。宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢(shì)。
　　 人乳頭瘤病毒（Humanpapillomaviruse，HPV）是引起宮頸癌病

2、變的首要因素。HPV是一類無包膜的DNA病毒，屬乳多空病毒科，根據(jù)其是否引起惡性病變，HPV分為兩種:低危型（如HPV6和HPV11等）和高危型（HPV16和HPV18等）。高危型的HPV與宮頸癌的發(fā)生有密切的關(guān)系，尤其是HPV16和HPV18。其中E6和E7是高危型HPV感染最重要的兩個(gè)癌基因，病毒基因組整合到人基因組增強(qiáng)了E6和E7的表達(dá)升高，E6和E7可分別抑制抑癌蛋白p53和Rb的表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化。
　

3、　 顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種自分泌生長因子，最初在侵襲性小鼠畸胎瘤中被發(fā)現(xiàn)。PGRN是一類組織分布廣泛、功能多樣的生長因子，參與了早期胚胎發(fā)生、傷口修復(fù)、生長發(fā)育等多種重要的生理活動(dòng)。研究表明，PGRN在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌和肝癌等腫瘤中具有致瘤功能，乳腺癌、卵巢癌和肝癌等中PGRN的高表達(dá)與腫瘤惡化相關(guān)，子宮內(nèi)膜癌和子宮平滑肌肉瘤的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)PGRN水平與腫瘤

4、的組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，表明PGRN具有用作腫瘤診斷標(biāo)志物的潛力。
　　 PGRN可激活典型的生長因子信號(hào)途徑，包括Erk信號(hào)途徑中shc和p42/44MAPK與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑中PI3K、蛋白激酶B/Akt和p70S6激酶的磷酸化。PGRN可啟動(dòng)結(jié)合素(integrin)相關(guān)信號(hào)途徑中胞漿酪氨酸激酶——成簇黏附激酶(FAK)的磷酸化。在膀胱癌細(xì)胞中PGRN驅(qū)使FAK與樁蛋白和p44/p42MAPK的結(jié)合，暗示P

5、GRN和細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)可能存在相關(guān)性。近期，在膽管上皮癌中發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)的PGRN可以通過Akt依賴性的機(jī)制調(diào)控叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(forkheadtranscriptionfactorsO1，F(xiàn)oxO1)的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 目前，PGRN在宮頸癌中的表達(dá)及功能還未見報(bào)道。本論文針對(duì)PGRN在宮頸癌中的表達(dá)，PGRN的表達(dá)對(duì)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響，以及對(duì)相關(guān)信號(hào)途徑的調(diào)控做了初步的探討。
　　 一、PGR

6、N在宮頸癌中的表達(dá)
　　 本研究使用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)了正常宮頸、宮頸癌組織的石蠟切片中PGRN的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宮頸癌組織中PGRN表達(dá)明顯高于正常宮頸組織。此外，使用westernblot檢測(cè)了宮頸癌細(xì)胞HeLa(HPV18+)、SiHa(HPV16+)和宮頸永生化細(xì)胞H8中PGRN的蛋白水平和培養(yǎng)基內(nèi)的分泌性PGRN的表達(dá)差異。Westernblot和Elisa檢測(cè)結(jié)

7、果發(fā)現(xiàn)，宮頸永生化細(xì)胞H8的胞內(nèi)和分泌性PGRN表達(dá)最低，而宮頸癌細(xì)胞HeLa表達(dá)最高。
　　 宮頸癌的形成與高危型HPVE6和E7蛋白密切相關(guān)，為了分析PGRN與癌蛋白E7之間是否存在相關(guān)性。本研究使用高表達(dá)HPV16-E7的人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE1)細(xì)胞系，通過westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)HPV16-E7的RPE1細(xì)胞(RPE116E7)的PRGN的表達(dá)水平明顯高于RPE1對(duì)照細(xì)胞，提示HPV16-E7可能是誘導(dǎo)

8、宮頸上皮細(xì)胞中PGRN表達(dá)水平增高的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素。
　　 本研究還調(diào)查了其他誘導(dǎo)因素對(duì)PGRN表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)IL-6、雌激素均可促進(jìn)PGRN在宮頸上皮細(xì)胞或?qū)m頸癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 上述研究結(jié)果表明，在宮頸癌組織中、宮頸癌細(xì)胞內(nèi)或胞外，PGRN均存在高表達(dá)現(xiàn)象。在宮頸上皮細(xì)胞中，HPV16-E7、IL-6和雌激素是可能造成PGRN表達(dá)上調(diào)的誘導(dǎo)因素。由此推測(cè)PGRN有可能通過某些途徑參與了宮頸癌的惡性轉(zhuǎn)化。
　

9、　 二、PGRN對(duì)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響
　　 為檢測(cè)PGRN是否影響宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞行為，本研究使用重組人PGRN(recombinanthumanPGRN，rhPGRN)處理H8細(xì)胞，或使用干擾RNA與表達(dá)載體分別抑制HeLa細(xì)胞與增強(qiáng)H8細(xì)胞內(nèi)PGRN的表達(dá)水平，進(jìn)而檢測(cè)其細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞遷移等能力。結(jié)果顯示，外源性PGRN處理和PGRN內(nèi)源性高表達(dá)均促進(jìn)了永生化細(xì)胞H8的增殖活性，克隆形成和遷移的能力。而干擾

10、PGRN表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞系HeLa的細(xì)胞增殖能力顯著下降。
　　 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PGRN低表達(dá)可顯著抑制HeLa細(xì)胞在裸鼠中的腫瘤生長能力。此外，將HPV癌基因E6/E7和Ha-ras轉(zhuǎn)化的小鼠肺上皮細(xì)胞TC-1接種于PGRN基因敲除小鼠和野生型小鼠，結(jié)果顯示TC-1細(xì)胞在基因敲除小鼠成瘤能力較野生型小鼠顯著降低。相反，永生化宮頸上皮細(xì)胞H8接種的裸鼠，分別進(jìn)行rhPGRN腹腔或瘤體注射可導(dǎo)致H8細(xì)胞成瘤。
　　

11、 本研究進(jìn)一步檢測(cè)了PGRN對(duì)抑癌基因Rb和p53的表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)H8細(xì)胞經(jīng)rhPGRN刺激后，Rb和p53的表達(dá)均明顯降低。
　　 以上體外和體內(nèi)研究均表明，PGRN可以促進(jìn)富頸癌永生化細(xì)胞的生長增殖和惡性轉(zhuǎn)化能力，而采用特異性siRNA干擾PGRN表達(dá)則導(dǎo)致富頸癌細(xì)胞HeLa的增殖能力的降低。PGRN促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞增殖等細(xì)胞行為可能與PGRN降低p53、pRb表達(dá)有關(guān)。
　　 三、PGRN對(duì)PI3K/Akt/mTO

12、R信號(hào)途徑的影響
　　 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑在癌癥中的作用一直以來都是腫瘤相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。PI3K/Akt與Erk信號(hào)均參與調(diào)控雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)途徑，Akt、p70S6K以及FoxO1也均為mTOR信號(hào)途徑的成員，提示PGRN激活的PI3K/Akt和Erk途徑可能涉及mTOR信號(hào)途徑。
　　 本研究首次較為全面的檢測(cè)了PGRN對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑的影響，結(jié)果顯示PGRN激活

13、了宮頸上皮永生化細(xì)胞H8中Akt和mTOR的磷酸化并調(diào)控了mTORC1下游信號(hào)途徑分子p70S6K、4E-BP1、FoxO1等的活性。PI3K/Akt抑制劑LY2940002的加入阻止了PGRN誘導(dǎo)的mTOR的激活，說明了PGRN誘導(dǎo)的mTOR磷酸化依賴于PI3K的活性。同時(shí)PGRN也可促進(jìn)mTORC2的活性，重組PGRN處理H8細(xì)胞可誘導(dǎo)mTORC2下游分子Akt473位絲氨酸磷酸化，促進(jìn)Akt控制的凋亡基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1的磷

14、酸化和出核失活。
　　 以上結(jié)果顯示PGRN激活了Akt/mTOR信號(hào)途徑，而Akt/mTOR信號(hào)途徑影響到許多重要的細(xì)胞功能，在調(diào)控基本的細(xì)胞行為如細(xì)胞生長、增殖與存活中具有關(guān)鍵作用。本研究進(jìn)一步證實(shí)了PGRN誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和抗凋亡等功能與PGRN激活的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑具有重要的相關(guān)性，從而能部分解釋了PGRN調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖的原因。
　　 綜上所述，本研究首次提出PGRN與宮頸癌的密切相關(guān)性。初步

15、探討了PGRN在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)的誘導(dǎo)因素以及PGRN促進(jìn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的功能及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本研究揭示了微環(huán)境因素對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制的影響，為包括宮頸癌在內(nèi)的PGRN相關(guān)腫瘤提供了新的治療靶位，有助于抗癌藥物的優(yōu)化和創(chuàng)新。
　　 第二部分RbAp48調(diào)控富頸癌細(xì)胞放射敏感性的研究
　　 宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居?jì)D女惡性腫瘤第2位。尤其是近年來出現(xiàn)全球發(fā)病年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的健康。據(jù)WH

16、O統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)宮頸癌病例50萬，約80％的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，中國約有15萬人，其中每年全球的死亡病例約20萬。
　　 大量研究資料表明人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）是宮頸癌發(fā)生的首要啟動(dòng)因子。HPV是一種無包膜的小DNA病毒，其中HPV16、18亞型對(duì)宮頸移行帶具高度親和力，與宮頸癌關(guān)系最為密切。HPV的轉(zhuǎn)化基因主要包括病毒的早期基因E6和E7，該基因編碼的蛋白產(chǎn)物與細(xì)胞生命周期的活性蛋

17、白相互作用，使細(xì)胞分化、增殖和凋亡紊亂，誘發(fā)腫瘤的形成。
　　 RbAp48，作為一種廣泛存在的Rb蛋白結(jié)合蛋白，能夠協(xié)同其他蛋白調(diào)節(jié)組蛋白及其核小體相關(guān)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HDAC)復(fù)合物的構(gòu)型和活性，從而抑制E2F調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。我們課題組之前的研究首先報(bào)道了RbAp48是一種具有調(diào)控HPV陽性宮頸癌轉(zhuǎn)化活性的重要蛋白，RbAp48在宮頸癌中低表達(dá)，在HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系中過表達(dá)RbAp48能夠抑制細(xì)胞的生長增殖及腫瘤形

18、成，其機(jī)制與RbAp48調(diào)節(jié)HPV癌基因E6、E7、c-myc，抑癌基因Rb、p53以及Rb/E2F靶位基因的表達(dá)有關(guān)，提示RbAp48有可能作為一種HPV相關(guān)腫瘤的治療靶位。
　　 新近研究發(fā)現(xiàn)，RbAp48也是一種放射敏感性蛋白。在對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性相關(guān)基因的篩選中，RbAp48作為被鑒定出來的三個(gè)重要基因中的其中之一，其在放射敏感細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于放射耐受細(xì)胞系。將RbAp48轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞系HS-578T、MDA-

19、MB-231以及黑色素瘤細(xì)胞系MALME-3M后，能夠明顯增加細(xì)胞周期中放射敏感階段G2/M的細(xì)胞比例，從而提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。目前宮頸癌的治療方法主要是手術(shù)和放療，尤其晚期以放療為主。與前列腺腫瘤、頭頸部軟組織腫瘤以及其它腫瘤類似，宮頸癌的治愈率在很大程度上取決于腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性。迄今，RbAp48與宮頸癌放射敏感性的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上將重點(diǎn)探討RbAp48與宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系及其作用機(jī)制

20、。
　　 一、RbAp48在放射后富頸癌細(xì)胞中的表達(dá)
　　 本研究將確定在宮頸癌中RbAp48是否是一種放射敏感性蛋白，即RbAp48的表達(dá)在射線照射前后是否有差別，以及這種差別是否決定細(xì)胞的放射敏感性。采用免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HPV陽性宮頸癌細(xì)胞SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞在x-射線照射前后的RbAp48表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示照射后的RbAp48在mRNA水平和蛋白水平均顯著升高，從而確定RbAp48在宮

21、頸癌細(xì)胞中是放射敏感蛋白。
　　 二、RbAp48對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響
　　 本研究分別自抑制RbAp48和過表達(dá)RbAp48的角度，觀察干預(yù)RbAp48對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長增殖及細(xì)胞放射敏感性的影響。用pcDNA3.1-RbAp48轉(zhuǎn)染SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞后構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)RbAp48的細(xì)胞系，用RbAp48特異的小干擾RNA和陰性對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制細(xì)胞內(nèi)RbAp48的表達(dá)。細(xì)胞接受不同劑量

22、x-射線處理后，通過CCK-8試劑、細(xì)胞計(jì)數(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察RbAp48對(duì)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RbAp48過表達(dá)能顯著抑制照射處理后細(xì)胞的增殖，克隆形成和惡性程度。而抑制RbAp48的表達(dá)，則能降低射線對(duì)細(xì)胞增殖生長的抑制作用。進(jìn)一步說明RbAp48確實(shí)能提高宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。
　　 三、RbAp48提高富頸癌細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制研究
　　 有研究報(bào)道

23、RbAp48能夠明顯增加乳腺癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞周期中放射敏感階段G2/M的細(xì)胞比例，從而提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。本研究將從細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和腫瘤相關(guān)基因分析對(duì)RbAp48促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制作初步探討。采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)過表達(dá)RbAp48、干擾RbAp48的宮頸癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞經(jīng)x-射線照射前后細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)照射前后各細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因p53，Rb和Caspase-8的表達(dá)變化。

24、r>　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，改變宮頸癌細(xì)胞內(nèi)RbAp48的表達(dá)或單獨(dú)射線處理均能一定程度的影響細(xì)胞周期和凋亡。過表達(dá)RbAp48能明顯引起射線處理宮頸癌細(xì)胞的G2/M阻滯和細(xì)胞凋亡;而射線引起的宮頸癌細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例和凋亡細(xì)胞數(shù)的升高，在細(xì)胞內(nèi)RbAp48表達(dá)被抑制后明顯下降。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果同樣顯示了過表達(dá)RbAp48或抑制RbAp48和射線處理均能夠改變SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞中的p53、Rb和Caspase-8的表

25、達(dá)水平。但過表達(dá)RbAp48聯(lián)合射線治療更為顯著的增強(qiáng)了p53、Rb和Caspase-8的表達(dá)水平，而干擾宮頸癌細(xì)胞RbAp48后，射線引起的p53、Rb和Caspase-8的表達(dá)升高明顯受到抑制。
　　 以上結(jié)果表明，宮頸癌細(xì)胞內(nèi)RbAp48的表達(dá)變化能顯著影響細(xì)胞照射后的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平，說明RbAp48促進(jìn)宮頸癌放射敏感性的作用是通過阻滯細(xì)胞周期G2/M期、增加細(xì)胞凋亡、促進(jìn)抑癌基因p53和Rb

26、以及凋亡相關(guān)基因Caspase-8的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
　　 四、腺病毒介導(dǎo)的RbAp48高表達(dá)對(duì)富頸癌細(xì)胞放射敏感性的影響
　　 為進(jìn)一步確定RbAp48在宮頸癌放射敏感性中的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了RbAp48重組腺病毒（Ad5-RbAp48），并進(jìn)行了動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。Westernblot結(jié)果顯示，Ad5-RbAp48能有效提高細(xì)胞中RbAp48的表達(dá)水平。裸鼠接種宮頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa成瘤后，分別接受Ad5-RbA

27、p48治療、射線治療和Ad5-RbAp48協(xié)同射線聯(lián)合治療，觀察裸鼠體內(nèi)成瘤的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ad5-RbAp48協(xié)同射線治療能有效的抑制富頸癌細(xì)胞成瘤，提高治療效果。說明腺病毒介導(dǎo)的RbAp48高表達(dá)明顯提高了宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。
　　 綜上所述，本研究首次提出了RbAp48與宮頸癌放射敏感性之間的密切關(guān)系，并初步探討了RbAp48提高宮頸癌細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示，x-射線能引起宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Cas