PGRN促宮頸癌及肝癌細(xì)胞增殖對(duì)Akt-mTOR信號(hào)途徑依賴(lài)性的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性婦科腫瘤。研究顯示宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染密切相關(guān),其早期蛋白E6、E7分別干擾細(xì)胞內(nèi)抑癌蛋白p53和pRb的功能,使其喪失對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)化。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞系和宮頸癌組織中顆粒蛋白前體Progranulin(PGRN)蛋白表達(dá)明顯增高,提示PGRN高表達(dá)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。
 

2、 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepato cellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)致死率前三位的惡性腫瘤之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),每年全世界約有100萬(wàn)人死于肝癌,我國(guó)也是肝癌的高發(fā)區(qū),死亡率僅次于肺癌。肝癌切除手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高,因此肝癌的治療依然是臨床上的研究熱點(diǎn)。研究顯示超過(guò)70%的HCC伴隨PGRN表達(dá)升高,PGRN高表達(dá)與肝癌細(xì)胞增殖、侵襲密切相關(guān),提示其可作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。
  PGRN是一種廣泛分布于

3、各組織細(xì)胞的自分泌生長(zhǎng)因子,具有多種生理功能。PGRN不僅參與胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)、炎癥調(diào)節(jié),在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也具有關(guān)鍵作用。已證實(shí)PGRN在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。它可通過(guò)激活MAPK/Erk、PI3K/Akt/mTOR、FAK等信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白合成,加速細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞侵襲,進(jìn)而參與腫瘤的進(jìn)展。Akt/mTOR信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等生理進(jìn)程。Akt/mTO

4、R信號(hào)通路的異常表達(dá)與胃癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),其促細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡、促血管形成等功能與腫瘤的形成密不可分。該信號(hào)通路也被作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)而進(jìn)行了廣泛的研究。
  目前,PGRN促宮頸癌及肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制還未明確。本文分兩部分初步探討了PGRN對(duì)宮頸癌、肝癌細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)途徑的調(diào)控作用及PGRN促宮頸癌、肝癌細(xì)胞增殖功能對(duì)該信號(hào)途徑的依賴(lài)性。
  1.PGRN促宮頸癌細(xì)胞生

5、長(zhǎng)增殖對(duì)Akt/mTOR信號(hào)途徑的依賴(lài)性
  目的:證明PGRN對(duì)宮頸癌細(xì)胞中Akt/mTOR和Erk等增殖相關(guān)信號(hào)分子活性的調(diào)控,以及PGRN調(diào)控宮頸癌和宮頸上皮細(xì)胞系增殖能力對(duì)Akt/mTOR信號(hào)途徑的依賴(lài)性。方法:使用重組人PGRN(rhPGRN)處理SiHa、HeLa細(xì)胞,免疫印記法檢測(cè)Akt、Erk、mTOR及mTORC1下游的p70S6K磷酸化水平。分別用CCK-8實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)等,檢測(cè)PI3K/Akt抑制劑

6、LY294002;MEK/Erk抑制劑U0126;mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)PGRN促宮頸細(xì)胞增殖、細(xì)胞惡化與存活能力的抑制作用。結(jié)果:免疫印跡結(jié)果顯示,rhPGRN處理的SiHa、HeLa細(xì)胞中p-Akt、p-Erk、p-mTOR磷酸化水平均顯著增強(qiáng),并促進(jìn)了mTOR下游p70S6K的磷酸化。細(xì)胞行為檢測(cè)結(jié)果顯示PI3K/Akt、MEK/Erk和mTOR抑制劑可抑制PGRN促進(jìn)的宮頸細(xì)胞增殖、增強(qiáng)H8細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞存活的能力。結(jié)論:PG

7、RN可激活宮頸癌細(xì)胞中Akt/mTOR與Erk信號(hào)途徑,PGRN對(duì)宮頸細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化與存活能力的促進(jìn)依賴(lài)或部分依賴(lài)于Akt/mTOR信號(hào)途徑的活化。
  2.PGRN促肝癌細(xì)胞增殖及成瘤能力對(duì)Akt/mTOR信號(hào)途徑的依賴(lài)性
  目的:探討PGRN激活的Akt/mTOR信號(hào)途徑對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖能力及成瘤能力的影響。方法:rhPGRN處理肝癌細(xì)胞HepG2,免疫印記法檢測(cè)Akt、Erk、mTOR及mTORC1下游的p

8、70S6K磷酸化水平。CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K/Akt抑制劑LY294002;MEK/Erk抑制劑U0126;mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)PGRN促細(xì)胞增殖的抑制作用。皮下注射HepG2細(xì)胞使裸鼠成瘤,瘤體注射rhPGRN或同時(shí)注射rhPGRN和雷帕霉素,測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)果:rhPGRN能夠明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中Akt、Erk、mTOR的磷酸化,及mTOR下游p70S6K的磷酸化。CCK-8及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Akt

9、/mTOR信號(hào)分子的抑制劑能夠降低PGRN促HepG2細(xì)胞增殖的作用。并且裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明,雷帕霉素能夠明顯抑制PGRN對(duì)肝癌細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)能力的促進(jìn)作用。結(jié)論:PGRN可激活肝癌細(xì)胞中Akt/mTOR與Erk信號(hào)途徑,體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均提示Akt/mTOR信號(hào)途徑的激活是PGRN介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制。
  綜上所述,本論文研究發(fā)現(xiàn)(1)PGRN可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞系SiHa和HeLa中Akt、Erk和mTOR的磷酸化,進(jìn)而活化mT

10、ORC1下游分子p70S6K;(2)PGRN可促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞H8與宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖、H8細(xì)胞的錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)與低濃度血清條件下的存活能力,并且PGRN調(diào)控宮頸細(xì)胞行為的功能依賴(lài)或部分依賴(lài)于其激活的Akt/mTOR信號(hào)途徑;(3)重組人PGRN處理可激活肝癌細(xì)胞系HepG2中Akt/mTOR信號(hào)途徑;(4)mTOR的抑制劑雷帕霉素可抑制PGRN促HepG2細(xì)胞增殖及裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的功能。
  本論文通過(guò)重組人PGRN刺激并

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