PGRN促宮頸癌及肝癌細(xì)胞增殖對Akt-mTOR信號途徑依賴性的研究.pdf

1、宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性婦科腫瘤。研究顯示宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染密切相關(guān)，其早期蛋白E6、E7分別干擾細(xì)胞內(nèi)抑癌蛋白p53和pRb的功能，使其喪失對細(xì)胞周期的調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)化。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞系和宮頸癌組織中顆粒蛋白前體Progranulin（PGRN）蛋白表達(dá)明顯增高，提示PGRN高表達(dá)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。
　

2、　原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepato cellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)致死率前三位的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年全世界約有100萬人死于肝癌，我國也是肝癌的高發(fā)區(qū)，死亡率僅次于肺癌。肝癌切除手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，因此肝癌的治療依然是臨床上的研究熱點。研究顯示超過70％的HCC伴隨PGRN表達(dá)升高，PGRN高表達(dá)與肝癌細(xì)胞增殖、侵襲密切相關(guān)，提示其可作為肝癌治療的潛在靶點。
　　PGRN是一種廣泛分布于

3、各組織細(xì)胞的自分泌生長因子，具有多種生理功能。PGRN不僅參與胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)、炎癥調(diào)節(jié)，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中也具有關(guān)鍵作用。已證實PGRN在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。它可通過激活MAPK/Erk、PI3K/Akt/mTOR、FAK等信號通路調(diào)節(jié)蛋白合成，加速細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞侵襲，進(jìn)而參與腫瘤的進(jìn)展。Akt/mTOR信號通路參與細(xì)胞生長、增殖、分化等生理進(jìn)程。Akt/mTO

4、R信號通路的異常表達(dá)與胃癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其促細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡、促血管形成等功能與腫瘤的形成密不可分。該信號通路也被作為腫瘤治療的新靶點而進(jìn)行了廣泛的研究。
　　目前，PGRN促宮頸癌及肝癌細(xì)胞增殖的分子機制還未明確。本文分兩部分初步探討了PGRN對宮頸癌、肝癌細(xì)胞中Akt/mTOR信號途徑的調(diào)控作用及PGRN促宮頸癌、肝癌細(xì)胞增殖功能對該信號途徑的依賴性。
　　1.PGRN促宮頸癌細(xì)胞生

5、長增殖對Akt/mTOR信號途徑的依賴性
　　目的:證明PGRN對宮頸癌細(xì)胞中Akt/mTOR和Erk等增殖相關(guān)信號分子活性的調(diào)控，以及PGRN調(diào)控宮頸癌和宮頸上皮細(xì)胞系增殖能力對Akt/mTOR信號途徑的依賴性。方法:使用重組人PGRN(rhPGRN)處理SiHa、HeLa細(xì)胞，免疫印記法檢測Akt、Erk、mTOR及mTORC1下游的p70S6K磷酸化水平。分別用CCK-8實驗、軟瓊脂克隆形成實驗等，檢測PI3K/Akt抑制劑

6、LY294002;MEK/Erk抑制劑U0126;mTOR抑制劑雷帕霉素對PGRN促宮頸細(xì)胞增殖、細(xì)胞惡化與存活能力的抑制作用。結(jié)果:免疫印跡結(jié)果顯示，rhPGRN處理的SiHa、HeLa細(xì)胞中p-Akt、p-Erk、p-mTOR磷酸化水平均顯著增強，并促進(jìn)了mTOR下游p70S6K的磷酸化。細(xì)胞行為檢測結(jié)果顯示PI3K/Akt、MEK/Erk和mTOR抑制劑可抑制PGRN促進(jìn)的宮頸細(xì)胞增殖、增強H8細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞存活的能力。結(jié)論:PG

7、RN可激活宮頸癌細(xì)胞中Akt/mTOR與Erk信號途徑，PGRN對宮頸細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化與存活能力的促進(jìn)依賴或部分依賴于Akt/mTOR信號途徑的活化。
　　2.PGRN促肝癌細(xì)胞增殖及成瘤能力對Akt/mTOR信號途徑的依賴性
　　目的:探討PGRN激活的Akt/mTOR信號途徑對肝癌細(xì)胞系HepG2增殖能力及成瘤能力的影響。方法:rhPGRN處理肝癌細(xì)胞HepG2，免疫印記法檢測Akt、Erk、mTOR及mTORC1下游的p

8、70S6K磷酸化水平。CCK-8實驗、克隆形成實驗檢測PI3K/Akt抑制劑LY294002;MEK/Erk抑制劑U0126;mTOR抑制劑雷帕霉素對PGRN促細(xì)胞增殖的抑制作用。皮下注射HepG2細(xì)胞使裸鼠成瘤，瘤體注射rhPGRN或同時注射rhPGRN和雷帕霉素，測量腫瘤的生長。結(jié)果:rhPGRN能夠明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中Akt、Erk、mTOR的磷酸化，及mTOR下游p70S6K的磷酸化。CCK-8及克隆形成實驗結(jié)果顯示，Akt

9、/mTOR信號分子的抑制劑能夠降低PGRN促HepG2細(xì)胞增殖的作用。并且裸鼠成瘤實驗證明，雷帕霉素能夠明顯抑制PGRN對肝癌細(xì)胞腫瘤生長能力的促進(jìn)作用。結(jié)論:PGRN可激活肝癌細(xì)胞中Akt/mTOR與Erk信號途徑，體外與體內(nèi)實驗均提示Akt/mTOR信號途徑的激活是PGRN介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機制。
　　綜上所述，本論文研究發(fā)現(xiàn)(1)PGRN可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞系SiHa和HeLa中Akt、Erk和mTOR的磷酸化，進(jìn)而活化mT

10、ORC1下游分子p70S6K;(2)PGRN可促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞H8與宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖、H8細(xì)胞的錨定非依賴性生長與低濃度血清條件下的存活能力，并且PGRN調(diào)控宮頸細(xì)胞行為的功能依賴或部分依賴于其激活的Akt/mTOR信號途徑;(3)重組人PGRN處理可激活肝癌細(xì)胞系HepG2中Akt/mTOR信號途徑;(4)mTOR的抑制劑雷帕霉素可抑制PGRN促HepG2細(xì)胞增殖及裸鼠腫瘤生長的功能。
　　本論文通過重組人PGRN刺激并