下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分:下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用
　　目的:
　　本研究擬探索RbAp48在人宮頸癌的表達(dá)情況，進(jìn)一步研究下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。
　　方法:
　　1.組織芯片法檢測224例人宮頸癌及癌旁組織中RbAp48的表達(dá);2.以siRNA干擾技術(shù)下調(diào)RbAp48的表達(dá);3.Western blot法檢測siRbAp48下調(diào)人宮頸癌細(xì)

2、胞RbAp48的表達(dá)水平;4.MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)RbAp48后對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株Hela、MS751、SiHa增殖的的影響;5.β-半乳糖苷酶染色檢測siRbAp48對(duì)Hela、MS751、SiHa細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)作用;6.流式細(xì)胞術(shù)檢測siRbAp48對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的作用;7.以荷瘤小鼠模型觀察下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1.RbAp48在人宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組

3、織，宮頸癌組織中呈強(qiáng)陽性者占67.86％（152例），而癌旁組織呈強(qiáng)陽性者為19.15％（9例）（**P＜0.01）。2.siRbAp48可有效下調(diào)Hela、MS751、SiHa細(xì)胞中RbAp48的表達(dá)。3.Hela細(xì)胞在20nM siRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的效果，50nM作用達(dá)峰值;效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第4天，其生存率降至36.11±4.47％。4.MS751細(xì)胞在10nMsiRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的效果，50n

4、M作用達(dá)峰值，效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第7天，其生存率降至47.80±5.08％。5.SiHa細(xì)胞在30nMsiRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的效果，50nM作用達(dá)峰值;效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第5天，其生存率為79.35±8.50％。6.細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Hela細(xì)胞siRNA NC對(duì)照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是87.17±8.63和36.67±2.89;MS751細(xì)胞siRNA NC對(duì)照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是

5、130±8.89和87.33±1.16;SiHa細(xì)胞siRNA NC對(duì)照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是36.67±2.31和31.67±2.09。7.Hela細(xì)胞在siRbAp48作用48小時(shí)后，G2/M期細(xì)胞比例上升為32.33±7.14％（**P＜0.01），顯示細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯; MS751細(xì)胞在siRbAp48作用96小時(shí)后G2/M期細(xì)胞比例上升為35.61±3.79％，顯示同樣發(fā)生了明顯的G2/M期阻滯。8.下

6、調(diào)RbAp48后Hela、MS751細(xì)胞胞內(nèi)顆粒增多，β-半乳糖苷酶染色出現(xiàn)藍(lán)染，呈明顯的衰老表征。9.Hela細(xì)胞在siRbAp48作用72小時(shí)出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，其凋亡率為54.65±9.06％(**P＜0.01); MS751細(xì)胞在siRbAp48作用120小時(shí)出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，其凋亡率為32.20±4.47％（*P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.RbAp48在人宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織細(xì)胞。2.si

7、RbAp48能有效下調(diào)人宮頸癌細(xì)胞中RbAp48的表達(dá)。3.下調(diào)RbAp48表達(dá)可至Hela、MS751細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老和凋亡，抑制細(xì)胞的增殖。4.下調(diào)RbAp48能增加人宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。
　　第二部分:下調(diào)RbAp48表達(dá)抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　目的:
　　探明下調(diào)RbAp48表達(dá)抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.Western blot法

8、檢測下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Cyclin蛋白表達(dá)的影響;2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證Cyclin蛋白家族在下調(diào)RbAp48抑制宮頸癌細(xì)胞生長中的作用;3.Western blot法檢測Cyclin作用下游蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Rb、E2F1等的表達(dá);4.以聯(lián)合共轉(zhuǎn)染的方法觀察相關(guān)蛋白在siRbAp48抑制宮頸癌細(xì)胞生長中的作用;5.MTT法檢測細(xì)胞體外增殖能力。
　　結(jié)果:
　　1.siRbAp48下調(diào)R

9、bAp48表達(dá)后，Hela、MS751細(xì)胞的CyclinD1、CyclinE1及CyclinH的表達(dá)均明顯下調(diào);相應(yīng)的CDK2、CDK4、CDK6蛋白也明顯下調(diào)。2.下調(diào)RbAp48表達(dá)后Hela、MS751細(xì)胞的磷酸化Rb(P-Rb)和E2F1明顯降低。3.與Hela、MS751細(xì)胞不同，SiHa細(xì)胞在下調(diào)RbAp48表達(dá)后，盡管Cyclin E1、CDK2、CDK4、CDK6、P-Rb、E2F1表達(dá)也均發(fā)生下調(diào)，但CyclinD1、

10、Cyclin H的表達(dá)并未發(fā)生明顯的變化。4.以siRb下調(diào)Rb表達(dá)后顯著拮抗siRbAp48對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;在Hela細(xì)胞，生存率由34.94±2.71％提高到56.12±2.72％（**P＜0.01）;在MS751細(xì)胞，生存率由44.24±5.83％提高到86.04±9.28％（**P＜0.01）;在SiHa細(xì)胞，生存率由80.03±7.65％提高到92.36±4.89％（**P＜0.01）。5.應(yīng)用siCyclin D1、s

11、iCyclin E1和siCyclin H能有效下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin H的表達(dá);下調(diào)Cyclin D1和Cyclin H的表達(dá)后，能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，但下調(diào)Cyclin E1表達(dá)后抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的效果則相對(duì)較弱。在Hela細(xì)胞中，siCyclin D1、siCyclin H和siCyclin E1組的生存率分別為39.19±7.77％、40.10±4.02％和82.83±5.9

12、4％;在MS751細(xì)胞中，siCyclinD1、 siCyclinH和siCyclinE1組的生存率分別為51.55±11.70％、49.61±7.51％和88.88±12.80％;在SiHa細(xì)胞中，siCyclin D1、 siCyclin H和siCyclinE1組的生存率分別為64.34±4.45％、80.74±11.57％和88.25±8.43％。6.以siRb下調(diào)Rb表達(dá)后能拮抗siCyclin D1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。在H

13、ela細(xì)胞，生存率由34.00±3.43％提高到46.54±2.96％（**P＜0.01）;在MS751細(xì)胞，生存率由50.41±4.17％提高到60.05±5.05％（**P＜0.01）;在SiHa細(xì)胞，生存率由66.05±6.56％提高到98.33±5.61％（**P＜0.01）。7.下調(diào)Rb表達(dá)后可拮抗siCyclin H對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。在Hela細(xì)胞，生存率由43.68±4.13％提高到77.54±5.47％（**P＜0.

14、01）;在MS751細(xì)胞，生存率由56.29±5.00％提高到86.84±6.95％（**P＜0.01）;在SiHa細(xì)胞，生存率由85.78±2.47％提高到97.54±3.57％（*半P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.下調(diào)RbAp48表達(dá)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞中CyclinD1、CyclinE、CyclinH的表達(dá)。2.下調(diào)CyclinD1或CyclinH后可產(chǎn)生與下調(diào)RbAp48相同的抑制細(xì)胞增殖的效果。3.siRb可拮

15、抗siRbAp48、siCyclin D1及Cyclin H抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的作用。4.下調(diào)CyclinD1、Cyclin H表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯是siRbAp48抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的一個(gè)重要機(jī)制。5.下調(diào)Rb表達(dá)可降低siRbAp48抑制宮頸癌增殖的效果，表明siRbAP48對(duì)腫瘤的抑制作用部分是通過調(diào)節(jié)Rb-E2F通路實(shí)現(xiàn)的。
　　第三部分:下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株MS751遷移侵襲的抑制及其機(jī)制研究

16、>　　目的:
　　探討了下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　以劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室檢測下調(diào)RbAp48表達(dá)后對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株MS751遷移侵襲的影響，以Western bolt檢測Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、Snail、Twist、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小

17、室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)RbAp48表達(dá)后MS751細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)均明顯減少。2.siRbAp48作用后MS751的間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Vimentin、N-cadherin、MMP-2表達(dá)明顯受到抑制;而上皮細(xì)胞表型蛋白E-cadherin、 TIMP-2表達(dá)明顯升高，表明MS751細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)樣變受到了抑制。3.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EMT上游調(diào)節(jié)蛋白Snail、Twist表達(dá)水平也發(fā)生了顯著下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　下調(diào)RbAp