硒化合物調控凋亡相關microRNA誘導宮頸癌細胞凋亡.pdf

1、目的:探討二氧化硒(SeO2)對宮頸癌細胞凋亡的誘導作用及其表觀調控機制,明確硒化合物抗腫瘤作用的機制,為其作為抗癌藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　方法:1.細胞培養(yǎng)與分組:選擇不同 HPV亞型宮頸癌細胞株 Hela細胞、Caski細胞作為實驗對象,用含10％FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細胞,置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期,隨機分為實驗組和空白對照組。實驗組予不同濃度 SeO2(1.875μmol/L、

2、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)處理24h,空白對照組予無血清培養(yǎng)基。根據(jù)待測指標需要取樣待測。
　　2.指標檢測:倒置光學顯微鏡下觀察不同組兩株細胞株經(jīng)過 SeO2處理后的形態(tài)學變化;用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測 SeO2對細胞增殖及活力的影響;利用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率;用 Western blot檢測細胞內凋亡相關蛋白 Caspase-3、P53蛋白表達的水平;St

3、ep-loop實時定量 PCR檢測細胞內凋亡相關 microRNA(miRNA) let-7a的表達水平。
　　結果:1.形態(tài)學觀察:倒置光學顯微鏡下可見,SeO2對體外培養(yǎng)的宮頸癌細胞株生長形態(tài)均產(chǎn)生明顯影響。與對照組細胞相比,細胞變圓皺縮,胞內顆粒增多,失去正常形態(tài),貼壁細胞減少,增殖減慢;隨著 SeO2作用濃度的提高,細胞密度逐漸降低,細胞間間隙逐步增大,呈劑量依賴性。
　　2.細胞增殖活力分析:采用 MTT法檢測 S

4、eO2對不同宮頸癌細胞株抑制作用,結果示 SeO2對宮頸癌細胞株的抑制作用呈量效依賴關系,Hela細胞各實驗組(1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)細胞抑制率分別為1.22%、20.25%、35.03%、43.56%、60.74%,其中7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度組與對照組差異顯著(P<0.05);SeO2對 Caski細胞的抑制作用隨藥物濃

5、度的升高亦呈明顯上升趨勢,各實驗組(1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)細胞抑制率分別為14.39%、34.08%、43.01%、57.73%、68.65%,與對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　3.凋亡檢測:運用流式細胞術檢測不同濃度 SeO2對宮頸癌細胞株的凋亡誘導作用。隨著 SeO2藥物濃度的升高,誘導作用逐漸增強,呈濃度依賴性。0μmol/L、1

6、.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度 SeO2誘導 Hela細胞凋亡率分別為3.12%、30.56%、33.42%、37.50%、45.43%、69.38%,0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度 SeO2誘導 Caski細胞凋亡率分別為3.7%、10.7%、67.5%、78.2%、87.1

7、%、85.2%,凋亡率均隨藥物濃度增加呈上升趨勢。
　　4. Caspase-3、P53蛋白表達水平測定:采用 Western blot技術分析不同細胞組凋亡相關蛋白表達水平,結果顯示 SeO2可明顯上調宮頸癌細胞株中 Caspase-3與 P53蛋白水平。對 Hela細胞的 Caspase-3、P53蛋白表達上調作用于7.5μmol/L處達到峰值,各實驗組較空白組均有顯著差異(P<0.05)。Caski細胞中低濃度組 Caspa

8、se-3蛋白誘導作用不明顯,至7.5μmol/L、15μmol/L及30μmol/L濃度蛋白表達量較空白組有顯著差異(P<0.05)。各實驗組對 P53蛋白水平的誘導作用較空白組均有顯著差異(P<0.05)。
　　5. Let-7a表達水平分析:Step-loop實時定量 PCR檢測不同組宮頸癌細胞株凋亡相關 miRNA let-7a表達,結果表明實驗組細胞 let-7a表達水平顯著提高,在7.5μmol/L處出現(xiàn)峰值,-⊿⊿Ct