科羅索酸誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡的生物學(xué)機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 科羅索酸促進CaSki宮頸癌上皮細胞凋亡的作用研究
　　目的：
　　宮頸癌是我國目前最常見的惡性腫瘤疾病之一。據(jù)不完全統(tǒng)計表明，宮頸癌已經(jīng)成為了女性惡性腫瘤的第二位，且發(fā)病年齡年輕化、發(fā)病率和死亡率逐年提高，從而嚴重威脅我國女性的健康和生命安全。在目前宮頸癌的臨床治療中，通常以化療藥物為主，然而作為化療藥物主體的西藥產(chǎn)生的毒副作用和耐藥性問題，嚴重威脅著患者的臨床預(yù)后和康

2、復(fù)效果。因此，從毒副作用小和耐藥性小的中藥中，篩選抗宮頸癌的藥物成為當(dāng)前臨床研究的熱點和難點。
　　科羅索酸(C30H48O4)作為一種天然的五環(huán)三萜化合物，來源于萼獼猴桃（貓人參）、枇杷、大葉紫薇等植物中。在多項臨床和藥理研究中指出，科羅索酸具有抗腫瘤、抗氧化、控制血糖和減肥的功效。在美國的減肥和糖尿病藥物開發(fā)中，科羅索酸已經(jīng)獲得了FDA的Ⅲ期臨床試驗階段。也有多項研究指出，科羅索酸能通過抑制腫瘤細胞的活性、促進腫瘤細胞凋亡和抑

3、制腫瘤內(nèi)的血管新生來起到很好的抗癌作用。同時科羅索酸是天然產(chǎn)物，而非人工合成，其生物相容性好，毒副作用和耐藥性低等特點，更突出了其在抗腫瘤藥物開發(fā)中的優(yōu)勢。因而，科羅索酸已經(jīng)成為了抗腫瘤新藥的熱門候選藥物之一。
　　然而，科羅索酸抗腫瘤的研究多集中在肝癌、胃癌和肺癌中，然而對于其在宮頸癌上的研究還沒有系統(tǒng)的報道。為了明確科羅索酸在宮頸癌治療中的作用和臨床價值，本文以不同濃度科羅索酸對人宮頸癌上皮細胞CaSki的凋亡活性的影響為研究

4、目標(biāo)，通過不同濃度科羅索酸與人宮頸癌上皮細胞CaSki混合培養(yǎng)，觀察人宮頸癌上皮細胞CaSki的細胞形態(tài)、增殖能力、凋亡能力、凋亡率、細胞周期，小鼠皮下成瘤能力、以及其小鼠皮下成瘤組織中CaSki的增殖能力的變化規(guī)律，從而系統(tǒng)和全面的揭示科羅索酸促進人宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡的作用規(guī)律，繼而為宮頸癌的預(yù)防和治療提供新的方法和策略。
　　方法：
　　本研究以科羅索酸對人宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡活性的影響為突破點，具體實

5、驗方法如下所述。
　　1.應(yīng)用不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）與宮頸癌上皮細胞CaSki混合培養(yǎng)，觀察宮頸癌上皮細胞CaSki的形態(tài)變化，從而分析不同濃度的科羅索酸對CaSki的細胞形態(tài)影向。
　　2.應(yīng)用MTT法和CCK-8法檢測不同組別的人宮頸癌上皮細胞CaSki的增殖情況，從而分析不同濃度的科羅索酸(0、10、20、50、100μg/mL)對CaSki細胞增殖抑制率的影響。
　　3.應(yīng)用AO

6、/PI染色和Hoechst33258染色檢測不同組別的人宮頸癌上皮細胞CaSki的細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化，尤其分析不同濃度的科羅索酸對CaSki細胞核的結(jié)構(gòu)變化以及凋亡小體形成的影響;同時依據(jù)CaSki細胞核的結(jié)構(gòu)變化確定凋亡和壞死細胞，從而計算不同組別CaSki細胞的凋亡和壞死率，繼而確定不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）對CaSki細胞凋亡的影響。
　　4.應(yīng)用流式細胞實驗分析不同組別的人宮頸癌上皮細胞CaS

7、ki的細胞周期，從而分析不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）對CaSki細胞周期的影響，繼而分析CaSki細胞出現(xiàn)凋亡的原因。
　　5.應(yīng)用流式細胞實驗分析不同組別的人宮頸癌上皮細胞CaSki的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率，繼而探明不同濃度的科羅索酸（0、10、50、100μg/mL）對CaSki細胞凋亡的作用規(guī)律。
　　6.應(yīng)用人宮頸癌上皮細胞CaSki構(gòu)建小鼠實體瘤模型，分別應(yīng)用空白組、科羅索酸組（

8、腹腔注射給藥，藥物濃度為10、50、100μg/mL），通過計算不同組別腫瘤的相對體積、重量和小鼠皮下成瘤抑制率，來研究不同濃度科羅索酸對CaSki在小鼠皮下成瘤能力的影響。
　　7.應(yīng)用免疫組化檢測成瘤小鼠的腫瘤組織中CaSki的增殖情況，從而確定不同濃度科羅索酸對CaSki體內(nèi)生長能力的影響。從而從動物和細胞水平驗證科羅索酸誘導(dǎo)宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡的作用。
　　結(jié)果：
　　1.科羅索酸能顯著抑制宮頸癌上皮細

9、胞CaSki的增殖活性，同時顯微鏡下觀察宮頸癌上皮細胞CaSki的細胞形態(tài)可知，隨著對宮頸癌上皮細胞添加的科羅索酸濃度的提升宮頸癌上皮細胞CaSki的細胞凋亡狀態(tài)的細胞逐漸增多，凋亡的CaSki細胞多呈現(xiàn)圓形，并從細胞團中脫落出來，并懸浮于培養(yǎng)液中，多以1個或幾個脆片狀存在，且體積較其他腫瘤細胞縮小，且細胞結(jié)構(gòu)不清晰，出現(xiàn)凋亡趨勢。
　　2.科羅索酸能促進宮頸癌上皮細胞CaSki的凋亡，應(yīng)用AO/PI染色和Hoechst33258

10、染色可見，科羅索酸能通過誘導(dǎo)CaSki的細胞核出現(xiàn)新月形、破碎狀的凋亡小體，同時也出現(xiàn)細胞核不規(guī)則移位來促進CaSki的凋亡。
　　3.10、50μg/mL科羅索酸能使得宮頸癌上皮細胞CaSki的更多停留在G0/G1期，從而降低宮頸癌上皮細胞CaSki的有絲分裂能力，繼而降低其增殖能力;10、50、100μg/mL科羅索酸能使得宮頸癌上皮細胞CaSki在S期占比顯著降低，從而縮短了CaSki在S期內(nèi)進行有絲分裂準(zhǔn)備的時間，從而導(dǎo)致

11、其進入G2/M期后遺傳物質(zhì)的缺失，促進其凋亡的形成;50、100μg/mL科羅索酸能使得宮頸癌上皮細胞CaSki在G2/M期，從而誘導(dǎo)CaSki的凋亡。
　　4.科羅索酸能提升宮頸癌上皮細胞CaSki的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率。
　　5.科羅索酸能通過降低宮頸癌上皮細胞CaSki在小鼠皮下成瘤中的腫瘤體積、重量，同時提升其在小鼠皮下成瘤的抑制率，來降低宮頸癌上皮細胞CaSki的在小鼠體內(nèi)成瘤能力。
　　6.科羅

12、索酸能通過減少腫瘤組織中的有增殖能力的腫瘤細胞的數(shù)量和降低其腫瘤組織的腫瘤增殖指數(shù)，來抑制宮頸癌上皮細胞CaSki在腫瘤組織中的增殖活性。
　　結(jié)論：
　　1.科羅索酸能通過抑制宮頸癌上皮細胞CaSki的增殖，提高CaSki的凋亡率，使CaSki細胞的細胞周期更多停滯在G0/G1期、G2/M期，縮短S期時間，誘導(dǎo)宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡。
　　2.科羅索酸對宮頸癌上皮細胞CaSki的增殖能力有抑制作用。
　　

13、第二部分 科羅索酸對CaSki宮頸癌上皮細胞的PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用研究
　　目的：
　　PI3K-Akt信號通路，是宮頸癌形成過程中最為重要的一類信號調(diào)節(jié)通路之一，主要參與宮頸癌細胞的增殖、凋亡、浸潤、遷移和腫瘤內(nèi)血管新生等諸多病理環(huán)節(jié)，在近代生命醫(yī)學(xué)研究中更是將其作為宮頸癌標(biāo)記物和治療靶點進行研究。國內(nèi)外專家對PI3K-Akt信號通路調(diào)控宮頸癌細胞的增殖、凋亡已經(jīng)達成了共識，認為蘇氨酸蛋白激酶AKT的激活必

14、須在PI3K蛋白的催化下，形成AKT磷酸化蛋白(p-AKT)，繼而激活PI3K-AKT-mTOR下游信號蛋白，來促進宮頸癌細胞的增殖和抑制宮頸癌細胞的凋亡。
　　由此可以推論，科羅索酸誘導(dǎo)宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡的作用與PI3K-Akt信號通路密切相關(guān)。為了驗證此推論，同時探索科羅索酸促進人宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡的生物學(xué)機制，本研究擬通過不同濃度科羅索酸與人宮頸癌上皮細胞CaSki混合培養(yǎng)，應(yīng)用western blot的

15、方法檢測人宮頸癌上皮細胞CaSki中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt表達量的變化，分析不同濃度科羅索酸對人宮頸癌上皮細胞中PI3K/Akt信號通路的影響，從而揭示科羅索酸通過作用PI3K/Akt信號通路來調(diào)控宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡的機理，繼而為進一步的開發(fā)宮頸癌治療的天然藥物提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　方法：
　　1.配置不同濃度的科羅索酸(0、10、50、100μg/mL)與宮頸癌上皮細胞CaSki混合培

16、養(yǎng)。
　　2.應(yīng)用Western Blot檢測不同組別的人宮頸癌上皮細胞CaSki的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表達量，從而確定科羅索酸通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，來促進宮頸癌上皮細胞CaSki凋亡的過程。
　　結(jié)果：
　　1.科羅索酸能抑制CaSki宮頸癌上皮細胞中PI3K總蛋白的表達;同時低濃度的科羅索酸能促進PI3K蛋白的磷酸化，從而誘導(dǎo)p-PI3K的高表達，而高濃度的科羅索酸卻能抑制PI3