巴豆生物堿體外誘導人宮頸癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：宮頸癌占婦科惡性腫瘤發(fā)病的第一位，發(fā)病率有逐年升高和發(fā)病年輕化的趨勢。隨著腫瘤學及腫瘤化學治療的基礎與臨床研究的迅速發(fā)展，化療在宮頸癌綜合治療中的作用日益受到重視?，F(xiàn)代研究表明，誘導腫瘤細胞凋亡是一條有效的腫瘤治療途徑，故尋求高效低毒的天然抗腫瘤藥物已成為腫瘤治療的研究熱點。
　　巴豆生物堿是巴豆中主要生物活性成分的總稱。近年來，體外實驗證實巴豆生物堿能夠通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤的發(fā)生。本研究以人宮頸癌Hela細胞株為對

2、象，通過檢測用藥前后Caspase-8的表達和活性變化，探討巴豆生物堿對宮頸癌細胞生長的影響及其作用機理，從而為巴豆生物堿應用于臨床腫瘤的輔助治療提供一定的實驗室依據(jù)。
　　方法：
　　1.細胞培育:常規(guī)復蘇凍存的Hela細胞懸浮培養(yǎng)于含10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入雙抗青霉素和鏈霉素(終濃度均為100U/mL)，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內松蓋培育。每兩天換一次液，細胞融合達80-90％時，以0.25

3、％胰蛋白酶消化、傳代。
　　2.MTT法觀察巴豆生物堿體外抑制Hela細胞的增殖作用。
　　3.PI染色檢測Hela細胞周期分布情況。
　　4.AnnexinⅤ-PI染色檢測細胞凋亡。
　　5.Caspase-8活性檢測。
　　6.RT-PCR檢測Caspase-8 mRNA的表達。
　　7.統(tǒng)計學方法:細胞吸光度值(OD)和Caspase-8表達用(x)±s表達，多組間比較，采用方差分析。計數(shù)資料用

4、x2檢驗。所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0 for windows軟件包進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　Hela細胞的形態(tài)學觀察巴豆生物堿處理48h后細胞數(shù)目減少，細胞明顯皺縮，體積變小，細胞間隙增大，有凋亡小體形成。MTT結果發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的巴豆生物堿處理人宮頸癌Hela細胞24、48h后，隨著藥物濃度和作用時間的增加，抑制率增高，表現(xiàn)為時間和劑量依賴關系。流式細胞術結果顯示:空白對照組Hela細

5、胞部分細胞進入S期和G2/M期，而巴豆生物堿能夠阻滯Hela細胞進入S和G2/M期，使細胞停滯于G0/G1期，各濃度的巴豆生物堿對Hela細胞凋亡率與空白組比較，48 h時間點明顯增高，且呈一定劑量依賴關系。經巴豆生物堿作用48小時后，Hela細胞Caspase-8活性明顯增加。而RT-PCR檢測經巴豆生物堿作用12小時后， Caspase-8 mRNA基因擴增產物與β-actin基因擴增產物電泳帶的吸光度比值明顯升高。
　　結論

6、：
　　1.巴豆生物堿對宮頸癌Hela細胞的生長有明顯的抑制作用，且隨時間和劑量增加抑制率明顯上升。
　　2.巴豆生物堿能夠通過抗有絲分裂、誘導凋亡途徑抑制Hela細胞增殖。
　　3.巴豆生物堿可在轉錄水平上調宮頸癌Hela細胞株Caspase-8mRNA的表達，亦可激活Caspase-8的活性，提示通過作用于caspase-8的表達，循半胱氨酸蛋白酶(caspase)通路誘導細胞凋亡是巴豆生物堿促凋亡的另一機制。