大黃素甲醚-8-O-β-葡萄糖苷(PG)誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡機制的研究.pdf

1、背景：
　　宮頸癌(cervical cancer，CC)為一類發(fā)生于婦女陰道以及子宮頸管的一類惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有婦女惡性腫瘤中排名第二位，因此是嚴重危害廣大婦女生命健康安全的惡性腫瘤之一。
　　中藥在治療宮頸癌方面具有顯著優(yōu)勢，國內(nèi)外大量基礎(chǔ)和臨床研究均證實中藥能夠經(jīng)由多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，具有綜合起效的特點，從而發(fā)揮預(yù)防和治療腫瘤的功效。目前，天然植物及其有效成分的抗腫瘤活性已經(jīng)初步得到國際醫(yī)學(xué)界所認可。

2、大黃素甲醚-8-0-β葡萄糖(physcion8-0-β-glucopyranoside，PG)為羊蹄跟含有的化學(xué)成分之一，目前的研究已經(jīng)證實PG具有抗腫瘤作用，但目前尚未有關(guān)于其在體內(nèi)或體外影響宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的研究。
　　目的：
　　本研究通過體外和體內(nèi)實驗兩方面對大黃素甲醚-8-0-β葡萄糖苷（physcion8-0-β-glucopyranoside，PG）對宮頸癌生物學(xué)行為的影響進行研究。我們首先通過體外實驗觀察P

3、G對宮頸癌HeLa細胞增殖的抑制作用，同時研究其能否誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡，檢測PG作用后凋亡相關(guān)蛋白的表達情況，從而明確PG對宮頸癌細胞生物學(xué)行為的影響。同時通過建立人宮頸癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，用以研究PG對HeLa細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用，從而進一步明確PG的體內(nèi)抗腫瘤作用。本研究旨在明確PG抗宮頸癌的作用機制，從而為其應(yīng)用于臨床抗宮頸癌治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　(1)將HeLa細胞隨機分為7個藥物終濃度

4、組，向每組細胞中加入對應(yīng)濃度的PG使之終濃度分別為5、10、20、40、60、80、100μg/mL，進行相應(yīng)處理24h后用CCK-8法檢測細胞增殖抑制率;用40μg/mL作用于HeLa細胞，分別于0、12、24、36、48、72h后終止培養(yǎng)，CCK-8法檢測各時間點細胞增殖抑制率。將HeLa細胞隨機分為對照組和20、40、60μg/mLPG組，進行相應(yīng)處理24h用DAPI染色實驗檢測細胞凋亡;TransweⅡ小室法檢測細胞侵襲細胞侵襲

5、活性;細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況;western blot法檢測caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白的表達水平。
　　(2)采用HeLa細胞經(jīng)皮下注射構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，選取20只已成功構(gòu)建的皮下移植瘤裸鼠模型，將之隨機分為對照組、10、20、40mg/kg PG組，進行相應(yīng)處理后觀察裸鼠日常情況;在給藥后第0、5、8、12、15天時運用游標(biāo)卡尺對各組裸鼠移植瘤的長度(L)和

6、寬度(W)，計算腫瘤體積，繪制移植瘤生長曲線;稱取腫瘤重量，計算抑瘤率;免疫組化法檢測各組裸鼠移植瘤中caspase-3和Bcl-2蛋白的表達;TUNEL實驗檢測移植瘤細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。
　　結(jié)果：
　　(1)當(dāng)PG濃度分別為5、10、20、40、60、80、100μg/mL時，HeLa細胞增殖的抑制率分別為(4.3±0.4)％、(18.8±1.7)％、(39.1±3.3)％、(42.2±4.2)％、(60.3±

7、6.5)％、(63.5±6.8)％、(66.4±6.6)％,IC50為41.34μg/mL。用40μg/m作用于HeLa細胞，分別于0、12、24、36、48、72h后終止培養(yǎng)，CCK-8法檢測各時間點細胞增殖抑制率。結(jié)果表明，PG作用后0、12、24、36、48、72h時細胞增殖抑制率分別為0、(36.4±7.8)％、(48.1±7.4)％、(63.3±6.4)％、(72.7±8.6)％。隨著PG作用濃度的升高，人宮頸癌HeLa細胞的

8、增殖抑制率也隨之增高，隨著PG作用時間的延長，HeLa細胞的增殖抑制也隨著上升。DAPI染色法檢測結(jié)果表明，在對照組中幾乎未見凋亡細胞，當(dāng)分別采用20、40、60μg/mL的PG細胞后，凋亡細胞數(shù)量逐漸增多，表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，顯微鏡下可見染色質(zhì)濃縮、細胞膜起泡，同時還能觀察到核固縮等。隨著PG作用濃度的增高，凋亡細胞數(shù)量逐漸增多。對照組、20、40、60μg/mL PG濃度組細胞的凋亡率分別為0、(13.6±3.5)％、(38

9、.4±6.7)％、(59.5±9.6)％，隨著PG作用濃度的增加，人宮頸癌HeLa細胞的凋亡率逐漸增高。Transwell小室法檢測結(jié)果表明，對照組，20、40、60μg/mLPG濃度組細胞的侵襲細胞數(shù)分別為(147±22)個、(115±17)個、(78±15)個、(52±12)個，各PG濃度組的侵襲細胞數(shù)均明顯低于對照組(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，隨著PG作用濃度的增加，人宮頸癌HeLa細胞的侵襲細胞數(shù)逐漸降低。細胞劃痕實驗檢測結(jié)

10、果表明，對照組、20、40、60μg/mL PG濃度組細胞的遷移距離分別為(365.7±49.5)μm、(288.6±37.3)μm、(231.4±34.6)μm、(156.5±27.9)μm，各PG濃度組的細胞的遷移距離均明顯低于對照組(P＜0.05)，且隨著PG作用濃度的增高，HeLa細胞的遷移距離逐漸減小。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，對照組、20、40、60μg/mL PG濃度組細胞的凋亡率分別為(0.4±0.1)％、(12.3±2.

11、9)％、(36.7±7.1)％、(61.3±8.3)％，各PG濃度組的細胞凋亡率均明顯高于對照組(P＜0.05)，隨著PG作用濃度的增加，人宮頸癌HeLa細胞的凋亡率逐漸增高。Western blot法檢測結(jié)果表明，對照組、20μg/mL PG組、40μg/mL PG組和80μg/mL PG組中Bax蛋白的相對表達量分別為(0.08±0.02)、(0.11±0.06)、(0.38±0.15)、(0.74±0.22)，各PG濃度組的細胞中

12、Bax蛋白的表達均明顯高于對照組(P＜0.05)，且隨著PG作用濃度的增高，Bax蛋白的表達也隨之上升;對各組細胞中Bcl-2蛋白的表達量進行檢測，對照組、20μg/mL PG組、40μg/mL PG組和80μg/mL PG組中Bax蛋白的相對表達量分別為(0.67±0.22)、(0.41±0.19)、(0.28±0.11)、(0.05±0.02)，各PG濃度組的細胞中Bcl-2蛋白的表達均明顯低于對照組(P＜0.05)，且隨著PG作用

13、濃度的增高，Bcl-2蛋白的表達水平逐漸降低;對各組細胞中Caspase-3蛋白的表達量進行檢測，對照組、20μg/mLPG組、40μg/mL PG組和80μg/mL PG組中Caspase-3蛋白的相對表達量分別為(0.04±0.01)、(0.13±0.05)、(0.28±0.11)、(0.64±0.27)，各PG濃度組的細胞中Caspase-3蛋白的表達均明顯高于對照組(P＜0.05)，且隨著PG作用濃度的增高，Caspase-9蛋

14、白的表達也隨之上升;對各組細胞中Caspase-9蛋白的表達量進行檢測，對照組、20μg/mL PG組、40μg/mL PG組和80μg/mL PG組中Caspase-3蛋白的相對表達量分別為(0.08±0.01)、(0.12±0.05)、(0.18±0.09)、(0.31±0.11)，各PG濃度組的細胞中Caspase9蛋白的表達均明顯高于對照組(P＜0.05)，且隨著PG作用濃度的增高，Caspase-9蛋白的表達也隨之上升。

15、>　　(2)本實驗中20只裸鼠均全部成瘤。移植瘤大小測量結(jié)果表明，各時間點PG作用組裸鼠的瘤體體積均明顯小于對照組(P＜0.05);隨著PG濃度的增高，裸鼠瘤體體積逐漸減小(P＜0.05)。TUNEL檢測結(jié)果表明，與對照組相比，各PG濃度組陽性細胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05);隨著PG作用濃度的增高，陽性細胞數(shù)逐漸降低(P＜0.05)。免疫組化檢測結(jié)果表明，Caspase-3蛋白染色的陽性部位主要分布于裸鼠移植瘤細胞的包漿，呈棕黃色顆粒

16、狀。與0mg/kg組相比，各PG濃度組裸鼠移植瘤細胞中Caspase-3蛋白的表達水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);隨著PG作用濃度的增高，裸鼠移植瘤細胞中Caspase-3蛋白的表達水平亦隨之增高。組間兩兩比較結(jié)果表明，10mg/kg組與20mg/kg組之間(x2=4.319，P=0.036)，10mg/kg組與40mg/kg組之間(x2=5.211，P=0.008)，20mg/kg組與40mg/kg組之間(x2=8

17、.419，P=0.003)Caspase-3蛋白的表達水平均存在明顯差異(P＜0.05)。Bcl-2蛋白染色的陽性部位主要分布于裸鼠移植瘤細胞的包漿，呈棕黃色顆粒狀。與0mg/kg組相比，各PG濃度組裸鼠移植瘤細胞中Bcl-2蛋白的表達水平均明顯減少(P＜0.05);隨著PG作用濃度的增高，裸鼠移植瘤細胞中Bcl-2蛋白的表達水平亦隨之減少。組間兩兩比較結(jié)果表明，10mg/kg組與20mg/kg組之間(x2=5.233，P=0.031)