桿狀病毒DNA甲基化及其在病毒復制過程中的作用初探.pdf

1、病毒感染宿主時，與宿主相互作用的許多方面涉及表觀遺傳學修飾，而這一修飾對某些病毒的感染過程和結(jié)果至關(guān)重要。已有的與病毒相關(guān)的表觀調(diào)控研究集中在一些潛伏性或非裂解性復制病毒，而較少關(guān)注裂解性病毒的表觀調(diào)控。本文研究了桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrosis，AcMNPV)在昆蟲細胞Sf9中進行裂解性復制時的DNA甲基化情況及其作用。

2、　　首先，通過使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC探究了低甲基化的細胞環(huán)境對AcMNPV復制的影響。經(jīng)30nM DAC預處理的細胞中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1被有效降解，感染后8h的病毒DNA水平是對照組的8倍，甲基化測序表明此時ie0啟動子區(qū)的甲基化水平較對照組低40％，ie1啟動子區(qū)甲基化水平則降低50％。測定病毒的生長曲線發(fā)現(xiàn)，30nM的DAC也會促進出芽型病毒BV的產(chǎn)生，使得在感染后的前24h中，病毒粒子釋放較對照組加快，但是這一差異隨

3、著培養(yǎng)時間的延長而趨于微弱，在最終的病毒效價上無明顯差異。這一結(jié)果初步確定了DNA甲基化水平的降低對病毒的DNA復制和出芽病毒的產(chǎn)生具有促進作用
　　為了弄清DAC是究竟通過影響病毒DNA的甲基化而直接影響病毒復制，還是通過影響細胞的基因表達狀態(tài)而間接影響病毒復制，我們我們進行了在DAC存在的細胞環(huán)境下的病毒連續(xù)傳代的實驗。DNA甲基化測序證實，病毒的重要基因ie0，ie1啟動子區(qū)的甲基化水平隨病毒連續(xù)傳代而持續(xù)降低。將得到的低甲

4、基化病毒進行感染細胞，發(fā)現(xiàn)這種“低甲基化”病毒在前48h內(nèi)DNA復制拷貝數(shù)平均為對照病毒的5倍，病毒極早期基因ie0、ie1、ie2和滯早期基因Dnapol、lef1、lef2的轉(zhuǎn)錄活性也有明顯提高。將“低甲基化”的桿狀病毒基因轉(zhuǎn)導哺乳細胞CHO，其介導的外源基因luciferase和egfp的表達水平也3倍高于對照病毒，表現(xiàn)出一定的應(yīng)用價值。
　　此外，還通過體外甲基化和瞬時表達實驗研究了病毒啟動子甲基化對其活性的影響。構(gòu)建了攜

5、帶病毒關(guān)鍵基因啟動子區(qū)的報告質(zhì)粒，體外甲基化修飾后轉(zhuǎn)染Sf9細胞，測定甲基化修飾對報告基因luciferase轉(zhuǎn)錄活性的影響，證實了病毒的一些關(guān)鍵基因如ie1、pe38的啟動子活性受甲基化修飾抑制，出入意料的是，p35、Dnapol、lef1、lef3、lef8的啟動子活性受甲基化修飾而略有激活。
　　綜上，DNMT1抑制劑DAC可以促進病毒DNA復制和出芽病毒粒子的釋放。與此相印證，低甲基化病毒感染細胞，DNA復制水平有明顯提高