乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)的甲基化及其調(diào)控HBV復(fù)制和基因表達(dá)的作用研究.pdf

1、盡管乙肝疫苗已普遍接種，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV屬于嗜肝DNA病毒，進(jìn)入宿主肝細(xì)胞核后形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄生成前基因組RNA(pre-genomic RNA，pg RNA)是HBV復(fù)制周期中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分分析了176例基因型A-J的HBV核苷酸序列中CpG島(CpG island，CGI)的分布及各型之間的差異。通過(guò)Me

2、thPrimer軟件分析發(fā)現(xiàn)HBV基因組有三個(gè)CpG島，存在被DNA甲基化修飾的基礎(chǔ)。島Ⅰ跨HBV S基因起始位點(diǎn)，島Ⅱ緊鄰核心啟動(dòng)子，和增強(qiáng)子Ⅰ、Ⅱ，與X基因啟動(dòng)子重疊，島Ⅲ包含HBV P基因的起始位點(diǎn)以及S基因啟動(dòng)子sp1。并且作為DNA甲基化作用靶點(diǎn)的CpG雙核苷酸在不同基因型HBV序列中的分布存在明顯差異，部分基因型HBV島Ⅰ缺失?；蛐虲、F、G、H和J基因型以2島分布為主，A、B、D、E和Ⅰ基因型以3島分布為主?；蛐虰、C

3、、D和H基因型中存在新的CGI?；蛐虲與基因型B的島Ⅰ區(qū)域的GC含量存在顯著差異。
　　第二部分分析了30例中國(guó)慢性乙型肝炎(CHB)患者肝組織中HBV cccDNA3個(gè)CpG島的甲基化分布情況。所有入選的患者均未接受過(guò)任何抗病毒治療。通過(guò)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方法處理肝組織中提取到的HBV cccDNA，PCR擴(kuò)增病毒基因組中的3個(gè)CGI，基因測(cè)序分析其甲基化程度。本實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果顯示CHB患者肝組織中的HBV cccDNA存在一定程

4、度的甲基化。其中，島Ⅰ中CpG雙核苷酸的胞嘧啶極少發(fā)生甲基化，只在5例(18.5％)的患者中檢測(cè)到少數(shù)位點(diǎn)發(fā)生甲基化。島Ⅱ的甲基化與血清病毒載量存在良好的線性關(guān)系，低病毒復(fù)制組(Log10 copies/mL＜5)的島Ⅱ甲基化程度顯著高于高復(fù)制組(Log10copies/mL≥5)，提示島Ⅱ的甲基化抑制病毒復(fù)制，可能與核心啟動(dòng)子活性受抑有關(guān)。年齡也是島Ⅱ發(fā)生甲基化的相關(guān)因素，年齡≥40歲患者的島Ⅱ甲基化程度高于年齡＜40歲組。此外，基因

5、型C患者的島Ⅱ甲基化程度高于基因型B組;HBeAg(-)患者島Ⅱ甲基化程度高于HBeAg(+)組;肝臟纖維化分期為S3-4患者的島Ⅱ甲基化程度高于纖維化分期S0-2組。我們的數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在島Ⅲ的甲基化與血清低HBsAg滴度有關(guān)，推測(cè)與sp1啟動(dòng)子活性受抑有關(guān)。
　　第三部分對(duì)體外研究HBV中單個(gè)CpG島功能的方法進(jìn)行了探索。目前僅有的HBV DNA甲基化體外研究方法是:采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶體外對(duì)3.2kb HBV線性單體進(jìn)行籠

6、統(tǒng)的修飾后，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2后，用real-time方法檢測(cè)病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，該方法明確了體外DNA甲基化抑制HBV病毒RNA的轉(zhuǎn)錄。但是，這種方法無(wú)法分析單個(gè)島的功能，即不能明確DNA甲基化介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制的作用靶點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)PCR方法分別擴(kuò)增CpG島(PCR產(chǎn)物不含甲基，而質(zhì)粒有甲基化修飾)，在體外對(duì)其進(jìn)行甲基化修飾后，再與其互補(bǔ)DNA片段連接成完整的3.2kb HBV環(huán)狀單體，體外轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，通過(guò)N

7、orthern blot和Southem blot分別檢測(cè)乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平，發(fā)現(xiàn)島Ⅱ甲基化的HBV單體的RNA轉(zhuǎn)錄水平以及病毒復(fù)制顯著低于對(duì)照組，即島Ⅱ甲基化參與HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控，與第二部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是一致的。此外，既往的觀點(diǎn)認(rèn)為，乙肝病毒的核心蛋白參與組成胞核內(nèi)的病毒微染色體，通過(guò)改變?nèi)旧w構(gòu)象調(diào)節(jié)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。本實(shí)驗(yàn)將核心蛋白正常表達(dá)或表達(dá)缺失的HBV線性單體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其HBV