ESR1基因甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭和HBV相關(guān)肝癌中的研究.pdf

1、第一部分:ESR1基因啟動(dòng)子甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭病情評(píng)估中的研究
　　研究背景
　　慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)是指在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)的基礎(chǔ)上，短期內(nèi)出現(xiàn)急性或亞急性的肝功能損害，主要表現(xiàn)為極度乏力、高膽紅素血癥、凝血功能障礙、失代償性腹水和肝性腦病，嚴(yán)重危及患者的生命健康。

2、ACHBLF進(jìn)行性發(fā)展，出現(xiàn)多器官功能衰竭，短期內(nèi)死亡率極高。早期診斷ACHBLF，在適宜的時(shí)間點(diǎn)采取恰當(dāng)?shù)母深A(yù)手段有可能降低ACHBLF的發(fā)病率和死亡率。
　　雖然終末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)已成為現(xiàn)階段得到廣泛應(yīng)用的精確評(píng)估肝病嚴(yán)重程度的評(píng)分系統(tǒng)，但此標(biāo)準(zhǔn)建立在肝硬化基礎(chǔ)之上，不是特異性的針對(duì)HBV感染所致的肝衰竭，而且用于ACHBLF患者的預(yù)后判斷時(shí)準(zhǔn)確性下降

3、，因此急需尋找一種可以在ACHBLF發(fā)展的早期階段就可以精確判斷其預(yù)后的標(biāo)記物。
　　臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，ACHBLF的發(fā)病率在男性患者遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性，這種性別差異可能是由于雌激素表達(dá)減少或是對(duì)雌激素的反應(yīng)性降低所致。在肝臟，雌激素只有與雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR），尤其是ESR1結(jié)合后才能發(fā)揮延緩肝細(xì)胞凋亡、改善肝纖維化、抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)功能。HBV可以促進(jìn)宿主ESR1基因的高甲基化，ESR1表達(dá)降低，誘

4、導(dǎo)肝病的發(fā)生，但ESR1基因啟動(dòng)子的異常甲基化在ACHBLF患者中所起的作用還未有研究。
　　研究目的
　　通過(guò)檢測(cè)對(duì)比健康人(Healthy controls，HC)、CHB、肝衰竭前期及ACHBLF早期、中期、晚期三期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，分析ESR1啟動(dòng)子的甲基化從HC、CHB、肝衰竭前期至肝衰竭時(shí)的動(dòng)態(tài)變化

5、并與ACHBLF患者的病情相結(jié)合，初步探討PBMC-ESR1啟動(dòng)子的甲基化作為無(wú)創(chuàng)性的指標(biāo)早期預(yù)測(cè)ACHBLF患者短期28天生存狀態(tài)的可行性。
　　研究方法
　　研究對(duì)象為2009年9月到2016年1月間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科接受治療的131例ACHBLF患者，隨機(jī)選取同一時(shí)間段的73例CHB患者和40例HC作為對(duì)照組。131例ACHBLF患者中，113人在入院時(shí)已被診斷為ACHBLF（包括早期患者67例，中期29例，晚期

6、17例），另外18人在住院期間從肝衰竭前期逐步進(jìn)展至ACHBLF，作為動(dòng)態(tài)觀察組。所有的ACHBLF患者追蹤隨訪28天。甲基化特異性PCR方法檢測(cè)HC組、CHB、肝衰竭前期和ACHBLF患者PBMC-ESR1基因啟動(dòng)子甲基化率，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)ESR1 mRNA的表達(dá)?？ǚ綑z驗(yàn)分析不同組ESR1甲基化率的比較，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響ACHBLF患者生存的危險(xiǎn)因素，Kaplan-Meier方法計(jì)算生存曲線，ROC曲線判斷PBMC

7、-ESR1啟動(dòng)子的甲基化早期判斷ACHBLF患者預(yù)后的合理性。
　　研究結(jié)果
　　1.ACHBLF組和CHB組在進(jìn)行HBeAg、HBeAb、HBV-DNA比較時(shí)無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;ACHBLF組、CHB組、HC組三組間比較時(shí)，年齡、性別、肌酐均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而顯示肝衰竭嚴(yán)重程度的總膽紅素、白蛋白、凝血酶原活動(dòng)度、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001); ACHBLF組中腹水、肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎的發(fā)生率分別

8、為66.37％、30.97％和27.43％，死亡率為67.26％。
　　ACHBLF患者生存組的總膽紅素(P=0.003)、肝性腦病的發(fā)生率(P=0.001)、MELD值(P＜0.001)明顯低于非生存組，其他臨床指標(biāo)均沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.ACHBLF患者PBMC-ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化率(66.37％)明顯高于CHB組（21.92％，P＜0.001）和HC組(11.54％，P＜0.001)，但CHB組和HC

9、組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;ACHBLF非生存組PBMC-ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化率顯著高于生存組(77.63％ vs29.73％，P＜0.001); ACHBLF患者甲基化組ESR1 mRNA的表達(dá)量明顯低于非甲基化組（P＜0.001）。
　　3.ACHBLF患者PBMC-ESR1啟動(dòng)子甲基化組的白蛋白水平顯著低于非甲基化組(P=0.027)，MELD值則高于非甲基化組（P=0.044），其他臨床指標(biāo)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.從

10、肝衰竭前期進(jìn)展至ACHBLF的動(dòng)態(tài)觀察中，ESR1啟動(dòng)子的甲基化率隨病情的嚴(yán)重程度變化，病情越危急，甲基化率越高。
　　5.Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型提示MELD值、肝性腦病、ESR1啟動(dòng)子的甲基化有可能是預(yù)測(cè)ACHBLF患者28天死亡率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　6.PBMC-ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化預(yù)測(cè)ACHBLF早期患者28天生存狀態(tài)的診斷價(jià)值明顯高于MELD評(píng)分＞24.6(P=0.015)。
　　結(jié)論
　　PBMC-

11、ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化與ACHBLF患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可能是預(yù)測(cè)早期ACHBLF患者短期28天生存狀態(tài)的無(wú)創(chuàng)性生物學(xué)指標(biāo)。
　　關(guān)鍵詞:雌激素受體1;慢加急性乙型肝炎肝衰竭;甲基化;預(yù)后;外周血單個(gè)核細(xì)胞
　　第二部分:血清ESR1、DNMT3b、CDH1基因的甲基化早期診斷HBV相關(guān)肝癌的研究
　　研究背景:
　　肝細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱肝癌）在我國(guó)惡性腫瘤相關(guān)性死亡中排名第二位，嚴(yán)重影響國(guó)民健康。乙型肝炎病毒

12、(Hepatitis B virus，HBV)是肝癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，HBV感染相關(guān)的肝癌又稱為HBV相關(guān)肝癌(HBV-related hepatocellularcarcinoma，HBV-related HCC)。盡管肝癌的綜合治療發(fā)展迅速，但5年生存率僅為30％-40％，而HBV-related HCC預(yù)后更差，不到12％。理想的治療效果取決于疾病的早期診斷和合理治療。血清甲胎蛋白和影像學(xué)檢查是目前診斷肝癌的主要檢測(cè)手段，但

13、是甲胎蛋白診斷肝癌時(shí)假陽(yáng)性和假陰性較高，影像學(xué)檢查在腫瘤體積較小時(shí)存在漏診。因此尋求一種新的腫瘤標(biāo)志物能夠從慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)和HBV相關(guān)肝硬化(HBV-related Liver cirrhosis，HBV-related LC)患者中早期篩查HBV-related HCC是臨床亟待解決的問(wèn)題。
　　基因啟動(dòng)子的異常甲基化被廣泛用作腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對(duì)化療藥物敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物。

14、HBV基因組編碼的HBx蛋白通過(guò)上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，引起基因啟動(dòng)子的高甲基化，表達(dá)下調(diào)，擾亂細(xì)胞正常的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡程序，最終導(dǎo)致HBV-related HCC的發(fā)生。
　　HBV-related HCC患者中男性占絕大多數(shù)，說(shuō)明雌激素信號(hào)通路可能具有抑制肝癌發(fā)生的作用。而雌激素只有與雌激素受體（Estrogen Receptor,ESR）（肝臟中以ESR1為主）結(jié)合后才能發(fā)揮抗氧化、抗肝纖維化、抗癌等生物學(xué)效應(yīng)，ESR

15、1基因組學(xué)的變異可能促進(jìn)HBV-related HCC的發(fā)生。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b（DNA methyltransferases3b.DNMT3b）是催化基因新生甲基化的關(guān)鍵酶。CDH1基因編碼的鈣粘附蛋白E，介導(dǎo)基底膜同種細(xì)胞問(wèn)的連接，鈣粘附蛋白E表達(dá)減少，細(xì)胞間粘附力降低，腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。既往研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌中存在不同程度的ESR1、DNMT3b和CDH1基因啟動(dòng)子的異常甲基化，但是目前并沒(méi)有ESR1、D

16、NMT3b和CDH1基因啟動(dòng)子甲基化的聯(lián)合檢測(cè)作為HBV-related HCC早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志物的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　研究目的
　　通過(guò)檢測(cè)對(duì)比HBV-related HCC、HBV-related LC、CHB和健康人(Normalcontrol, NC)血清中ESR1、DNMT3b和CDH1基因啟動(dòng)子的甲基化率，分析HBV-related HCC進(jìn)展過(guò)程中不同基因的異常甲基化與病例資料的相關(guān)性，探討血清基因啟動(dòng)子甲基化

17、的聯(lián)合檢測(cè)用于早期診斷HBV-related HCC的可行性。
　　研究方法
　　研究選取2011年1月至2013年5月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院治療的183例肝癌患者作為實(shí)驗(yàn)組，包括153例HBV-related HCC患者和30例非HBV相關(guān)肝癌患者(Non-HBV-related HCC)，隨機(jī)選取同一時(shí)間段的47例HBV相關(guān)肝硬化和126例CHB、50例NC作為對(duì)照組。甲基化特異性PCR方法分析不同人群血清ESR1、DNMT

18、3b和CDH1基因啟動(dòng)子的甲基化率。卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)用于不同組不同基因啟動(dòng)子甲基化率的比較，ROC曲線分析三個(gè)基因甲基化的聯(lián)合檢測(cè)早期診斷HBV相關(guān)肝癌的合理性。
　　研究結(jié)果
　　1.HBV-related HCC患者血清中ESR1(30.07％)、DNMT3b(41.18％)和CDH1(27.45％)的甲基化率顯著高于HBV-related LC患者(P＜0.001，P＜0.001，P=0.007)、CHB

19、患者（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）和NC組（P＜0.001，P＜0.001， P＜0.001）。但是，三個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化率在NC和CHB、NC和HBV-related LC、CHB和HBV-related LC之間差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.Non-HBV-related HCC患者CDH1基因啟動(dòng)子的甲基化率(46.67％)顯著高于HBV相關(guān)肝癌患者(27.45％，P=0.037)，而DNMT3b(P

20、=0.905)和ESR1(P=0.709)的甲基化率在兩者之間均沒(méi)有顯著性差異。
　　3.HBV-related HCC患者合并肝硬化時(shí)ESR1基因啟動(dòng)子的甲基化率顯著高于未合并肝硬化者（P=0.005），手術(shù)切除組ESR1的甲基化率明顯高于采取其他治療措施組（P=0.027）;DNMT3b的甲基化率在腫瘤直徑大于10厘米的患者中高于3-10厘米患者(P=0.028)，單個(gè)結(jié)節(jié)的甲基化率顯著高于多個(gè)結(jié)節(jié)者(P=0.045);男性C

21、DH1的甲基化率明顯高于女性（P=0.026）。而三個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化均與甲胎蛋白、e抗原、腫瘤細(xì)胞的分化程度、大血管侵犯、肝內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶無(wú)關(guān)。
　　4.Non-HBV-related HCC患者血清中ESR1甲基化率在AFP≥400 ng/mL組顯著高于AFP＜400 ng/mL組(P=0.048);DNMT3b的甲基化率在腫瘤直徑小于3厘米的患者中高于3-10厘米患者（P=0.010）;CDH1啟動(dòng)子的甲基化率與性別、年齡、

22、腫瘤直徑、結(jié)節(jié)數(shù)目、e抗原、甲胎蛋白、合并肝硬化、腫瘤細(xì)胞的分化程度、大血管侵犯、肝內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶、治療方式等均沒(méi)有相關(guān)性。
　　5.兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生甲基化的組合中，血清CDH1和ESR1同時(shí)發(fā)生甲基化的概率在HBV-relatedHCC患者中為21.62％，而在Non-HBV-related HCC患者中這一組合發(fā)生的概率為0。
　　6.從CHB患者中辨別HBV-related HCC時(shí)，甲基化聯(lián)合檢測(cè)的敏感性是84.48％

23、，特異性66.26％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值2.50，陰性預(yù)測(cè)值0.23，曲線下的面積(Thearea under ROC curves，AUC)顯著高于甲胎蛋白(P=0.003);從HBV-related LC患者中診斷HBV-related HCC時(shí)，甲基化聯(lián)合檢測(cè)的AUC明顯高于血清甲胎蛋白(P=0.045)。
　　結(jié)論
　　1.HBV-related HCC患者血清中較常出現(xiàn)ESR1、DNMT3b、CDH1基因啟動(dòng)子的異常高甲基