乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志物鑒定與研究.pdf

1、背景:
　　乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭（Hepatitis B-related Acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF）在亞太地區(qū)有很高的死亡率，但是它的發(fā)生發(fā)展機制尚不清楚。建立敏感且特異的生物標(biāo)志物，用于HBV-ACLF的早期診斷和疾病進展預(yù)測，對于確定哪些病人需要盡早地治療和接受肝移植手術(shù)非常重要。最近，已有研究報道將外周血中的微小RNA(miRNA)和信號蛋白作為很多疾病無創(chuàng)診斷的潛

2、在生物標(biāo)志物，其中也包括一些肝臟疾病。
　　材料和方法:
　　在第一章中，我們用高通量測序技術(shù)研究來自HBV-ACLF組、慢性乙型肝炎（CHB）組和健康對照(Healthy)組的12例（每組4例）樣本外周血單個核細胞(PBMC)中的miRNA表達譜，從中尋找HBV-ACLF的全新miRNA標(biāo)志物。首先提取所有樣本的PBMC中的miRNA，用HiSeq2000測序儀對其進行深度測序;然后使用miRDeep2軟件從測序結(jié)果中分析

3、已知miRNA的表達量并鑒定未知的全新miRNA，再用DESeq2分析在HBV-ACLF中表達失調(diào)的miRNA;最后，在另外的30例（每組10例）樣本中用基于TaqMan探針技術(shù)的實時定量PCR方法(qRT-PCR)來驗證失調(diào)miRNA的表達量和確認全新miRNA的表達情況。
　　在第二章中，我們用含有274個人類細胞因子蛋白抗體的芯片檢測來自HBV-ACLF組、CHB組和Healthy組的15例（每組5例）血清樣本中的信號蛋白表

4、達情況，從中篩選全新的HBV-ACLF血清蛋白標(biāo)志物。用芯片顯著性分析(SAM)和芯片預(yù)測分析（PAM）兩種方法找出差異表達的蛋白，然后用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)在279例HBV-ACLF樣本、116例CHB樣本和20例健康樣本中驗證顯著差異蛋白的表達量，再對各組樣本的驗證結(jié)果進行聚類分析，找出能將HBV-ACLF樣本與CHB和Healthy樣本進行正確區(qū)分的信號蛋白。此外，我們根據(jù)HBV-ACLF樣本的三個月死亡情況和驗證結(jié)果

5、中信號蛋白的表達水平，通過生物信息學(xué)分析找出與HBV-ACLF死亡率密切相關(guān)的信號蛋白，然后將另外136例HBV-ACLF樣本作為外部驗證組，用于驗證該信號蛋白預(yù)測HBV-ACLF死亡率的能力。
　　結(jié)果:
　　在第一章中，用高通量測序技術(shù)對HBV-ACLF組、CHB組和Healthy組的PBMC中miRNA表達譜進行研究后，我們發(fā)現(xiàn)有1167個已知miRNA和107個全新miRNA至少在一個樣本中有表達，其中，78個miR

6、NA在HBV-ACLF病人中的表達水平與CHB病人和健康人中的相比有顯著差異。通過進一步分析，我們找到了7個上調(diào)和1個下調(diào)的miRNA，它們在HBV-ACLF病人中的表達水平與CHB和Healthy組中的相比都有4倍以上的變化，同時它們在HBV-ACLF組中的測序讀長片段(Read)數(shù)量高于該組的中位數(shù)。用qRT-PCR方法對這8個miRNA的表達量進行驗證后，發(fā)現(xiàn)其中6個miRNA(hsa-miR-21-5p, hsa-miR-34c

7、-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-143-5p,hsa-miR-374a-3p和hsa-miR-542-3p)的表達量在HBV-ACLF病人中顯著升高，這個結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致，但是另外兩個miRNA在HBV-ACLF病人中的表達水平與其他兩組相比沒有顯著變化。Gene Ontology(GO)通路分析顯示上述6個差異表達miRNA的靶基因主要參與了系統(tǒng)發(fā)育、信號調(diào)節(jié)、RNA代謝過程和基因表達等生物學(xué)過程。此

8、外，我們用qRT-PCR方法對5個在測序結(jié)果中表達量最高的全新miRNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)它們在三組樣本的PBMC中均有表達，而且其中兩個在HBV-ACLF中的表達量顯著上升。
　　在第二章中，細胞因子抗體芯片的初始篩選找到了在HBV-ACLF病人中顯著差異表達的15個蛋白，這15個蛋白主要參與了細胞識別、炎癥、細胞粘附、血管生成和細胞調(diào)控等生物學(xué)過程。其中有6個蛋白(肝細胞生長因子(HGF)、巨噬細胞炎癥蛋白3α(MIP-3α)、癌

9、胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(CEACAM1)、生長分化因子15(GDF15)、選擇蛋白E(E-selectin)和骨橋蛋白(Osteopontin))在HBV-ACLF病人中的表達量遠高于在CHB病人和健康人中的表達量。用ELISA方法在279例HBV-ACLF病人與116例CHB病人和20例健康人的血清樣本中對這6個蛋白的表達量進行驗證，驗證結(jié)果與抗體芯片的結(jié)果基本一致。通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)僅用HGF和GDF15就可以將HBV-ACLF組

10、樣本與CHB和Healthy組樣本正確區(qū)分開。此外，我們發(fā)現(xiàn)在ELISA實驗組中MIP-3α與HBV-ACLF病人的死亡率密切相關(guān)，外部驗證組的結(jié)果也顯示MIP-3α可以用于預(yù)測HBV-ACLF病人的死亡率。同時，免疫組化結(jié)果顯示HGF、GDF15和MIP-3α在HBV-ACLF來源的肝組織中表達為陽性，而在CHB和Healthy來源的肝組織中表達為陰性。
　　結(jié)論:
　　HBV-ACLF病人PBMC中的miRNA表達譜和血