SOCS1基因與慢加急性乙型肝炎肝衰竭病情評價(jià)及激素治療的研究.pdf

1、第一部分SOCS1基因在慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的表達(dá)及其甲基化狀態(tài)的檢測
　　研究背景
　　慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronichepatitisBliverfailure，ACHBLF)是指由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)慢性感染的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)急性肝功能失代償，繼發(fā)嚴(yán)重的肝臟損害的嚴(yán)重癥候群。ACHBLF在我國慢性乙型肝炎患者中發(fā)病率較高，以凝血功能障礙，黃疸，肝性腦病，腹水為

2、主要表現(xiàn)，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，病程兇險(xiǎn)死亡率極高。目前，細(xì)胞因子在肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到人們的重視，一方面細(xì)胞因子可使淋巴細(xì)胞活化，參與免疫反應(yīng)清除病毒;另一方面細(xì)胞因子直接參與和加重肝衰竭的演變過程，引起免疫病理反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞的壞死。
　　細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(Suppressorofcytokinesignaling，SOCS)1屬于SOCS蛋白家族，是一類由細(xì)胞產(chǎn)生并反饋性阻斷細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的負(fù)

3、性調(diào)節(jié)因子之一。研究發(fā)現(xiàn)SOCS1可通過負(fù)反饋環(huán)抑制炎癥細(xì)胞因子信號的傳導(dǎo)，在多種免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。而HBV可能導(dǎo)致宿主基因甲基化，使SOCS1表達(dá)降低，對炎癥因子的抑制作用減弱，可能會加重肝臟的炎癥損害。
　　研究表明，SOCS1基因的甲基化與慢性病毒性肝炎的炎癥、纖維化及抗病毒治療存在著一定的相關(guān)性。但是在慢加急性乙型肝炎肝衰竭中SOCS1基因表達(dá)及啟動子的甲基化的情況與炎癥因子的關(guān)系還未有研究。
　　研究目的

4、r>　　通過檢測ACHBLF患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)SOCS1的mRNA表達(dá)情況、啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及血漿中相關(guān)炎癥因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）水平。并與慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者及正常人進(jìn)行比較，分析SOCS1的甲基化與肝臟免疫損傷的關(guān)系，并初步探討其在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者

5、發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床相關(guān)性。
　　研究方法
　　研究對象為2009年6月到2013年3月間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院和煙臺傳染病醫(yī)院就診和治療的60例ACHBLF患者，60例CHB患者，以及30例門診健康體檢者作為對照。ACHBLF患者診斷符合亞太肝臟研究協(xié)會年會(APASL)標(biāo)準(zhǔn)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativePCR，RT-PCR)方法檢測ACHBLF、CHB患者及健康對照外周血單個(gè)核細(xì)胞中S

6、OCS1的表達(dá)情況，并通過甲基化特異性PCR(Methylation-specificPCR，MSP)檢測SOCS1啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）方法檢測ACHBLF、CHB患者及健康對照血漿中IL-6，IFN-γ和TNF-α的水平。并將SOCS1表達(dá)量IL-6，IFN-γ和TNF-α的水平與病情嚴(yán)重指標(biāo)總膽紅素(Totalbilirubin，TB

7、IL)、凝血酶原活動度（Prothrombinactivity,PTA）、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)、HBV-DNA及MELD評分進(jìn)行相關(guān)分析。比較不同SOCS1基因啟動子去甲基化狀態(tài)患者臨床指標(biāo)及預(yù)后。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間差異采用兩組獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異具

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果
　　1.ACHBLF患者組和CHB患者組血漿IL-6及TNF-α水平明顯高于健康對照組(P＜0.05);ACHBLF患者組的IL-6及TNF-α水平在三組中最高，明顯高于CHB患者組(P＜0.05)。ACHBLF患者組血漿IFN-γ水平明顯高于CHB患者組，但與健康對照組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.ACHBLF及CHB患者的SOCS1mRNA表達(dá)量明顯高于健康對照組(P＜0.01);A

9、CHBLF患者組的SOCS1表達(dá)量明顯高于CHB患者組(P＜0.05)。
　　3.ACHBLF患者細(xì)胞因子IL-6/IFN-γ/TNF-α水平與TBIL、ALT及MELD評分呈正相關(guān)，與PTA呈負(fù)相關(guān)，與HBV-DNA載量無明顯相關(guān)性。
　　4.ACHBLF患者的SOCS1基因mRNA水平與TBIL、ALT成負(fù)相關(guān)，與PTA成正相關(guān)。另外SOCS1表達(dá)量與ACHBLF患者IL-6/IFN-γ/TNF-α水平分別成負(fù)相關(guān)。與H

10、BVDNA載量及MELD評分無明顯相關(guān)性。
　　5ACHBLF患者組的SOCS1基因啟動子的甲基化率(35.0％)明顯高于CHB患者組(16.7％，x2=3.52，P=0.003)，在30例健康對照中均未發(fā)現(xiàn)SOCS1啟動子區(qū)的甲基化。
　　6.在ACHBLF及CHB患者患者中，甲基化組的SOCS1基因表達(dá)量明顯低于非甲基化組。ACHBLF患者SOCS1啟動子區(qū)甲基化組的IL-6/IFN-γ/TNF-α水平、TBIL和ALT

11、水平明顯高于非甲基化組，而PTA水平則明顯低于非甲基化組。另外，ACHBLF患者甲基化組的MELD積分及死亡率高于非甲基化組。
　　結(jié)論
　　SOCS1的表達(dá)量與患者的病情嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)，SOCS1基因啟動子區(qū)的甲基化可能參與了相關(guān)炎癥因子對慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者肝功能的免疫損害。
　　第二部分SOCS1基因甲基化及表達(dá)與糖皮質(zhì)激素治療慢加急性乙型肝炎肝衰竭的研究
　　研究背景
　　慢加急性肝衰竭的發(fā)

12、生不同時(shí)相依次經(jīng)受了免疫損傷、缺血缺氧性損傷和內(nèi)毒素血癥的三重打擊，其中炎癥因子參與的免疫損傷在肝衰竭發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。肝病尤其是肝衰竭患者普遍存在著腎上腺功能不全的情況，因此早期使用糖皮質(zhì)激素是治療慢加急性肝衰竭的方法之一，近年來隨著對糖皮質(zhì)激素不良反應(yīng)及并發(fā)癥防治手段的增強(qiáng)，使用糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)患者機(jī)體免疫功能、抑制炎性反應(yīng)已經(jīng)成為治療慢加急性肝衰竭的一種選擇。
　　第一部分的研究已經(jīng)證實(shí)了SOCS1基因啟動子區(qū)的甲基化

13、參與了相關(guān)炎癥因子對ACHBLF患者的肝功能損害。但ACHBLF患者中糖皮質(zhì)激素對SOCS1的影響及對患者預(yù)后是否有提示作用尚未有研究。既往研究資料證實(shí)糖皮質(zhì)激素在體內(nèi)、體外環(huán)境均能夠促進(jìn)SOCS1基因表達(dá)并引起甲基化狀態(tài)改變。據(jù)此我們推測對ACHBLF患者采用糖皮質(zhì)激素治療可能影響SOCS1對相關(guān)的炎癥反應(yīng)的調(diào)控。本研究有助于我們認(rèn)識糖皮質(zhì)激素治療對ACHBLF患者SOCS1的表達(dá)及甲基化狀態(tài)的影響，揭示SOCS1對糖皮質(zhì)激素治療AC

14、HBLF的提示作用，為提供臨床治療理論依據(jù)和新的途徑。
　　研究目的
　　通過研究糖皮質(zhì)激素治療對ACHBLF患者SOCS1表達(dá)，甲基化狀態(tài)及相關(guān)基因、細(xì)胞因子的影響，進(jìn)一步探討分析SOCS1表達(dá)與糖皮質(zhì)激素激素治療預(yù)后的相關(guān)性。
　　研究方法
　　研究對象為2007年12月到2013年5月間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診和治療的ACHBLF患者47例，以及30例門診健康體檢者作為對照。ACHBLF患者診斷符合亞太肝臟研

15、究協(xié)會年會(APASL)標(biāo)準(zhǔn)。所有ACHBLF患者確診后均給予糖皮質(zhì)激素治療4周。應(yīng)用RT-PCR法檢測ACHBLF患者治療前，治療第3天及治療28天后SOCS1及干擾素調(diào)節(jié)受體(interferonregulatoryfactors，IRF)-1，趨化因子配體(C-X-Cmotifligand，CXCL)9，CXCL10，CXCL11的表達(dá)情況，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測ACHBLF患者和健康對照血漿中IL-6及TNF-α水平，結(jié)合患者臨

16、床指標(biāo)，與MELD評分進(jìn)行相關(guān)分析，用甲基化特異性PCR法(MethylationSpecificPCR，MSP)測定SOCS1基因啟動子的甲基化狀態(tài)，分析糖皮質(zhì)激素對SOCS1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響，探討SOCS1表達(dá)與糖皮質(zhì)激素治療的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間差異采用兩組獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義。
　　研究結(jié)果
　　1.激素治療后ACHBLF患者肝性腦病和腹水癥狀均有明顯改善。MELD積分明顯下降。
　　2.激素治療前，ACHBLF患者SOCS1基因mRNA基因表達(dá)水平明顯高于健康對照(P＜0.05);ACHBLF生存組的SOCS1mRNA表達(dá)量明顯高于死亡組(P=0.007)。激素治療第三天，生存組SOCS1表達(dá)量上升;治療第28天，生存組SOCS1基因mRNA表達(dá)量明顯下降，而死亡組在治療中及治療后SO

18、CS1基因mRNA表達(dá)量無明顯變化。
　　3.激素治療前，ACHBLF患者血漿IL-6及TNF-α水平明顯高于健康對照(P＜0.05);激素治療后第三天，ACHBLF患者IL-6及TNF-α水平出現(xiàn)明顯下降，其中死亡組TNF-α水平明顯高于生存組，而兩組IL-6水平在治療第3天無明顯差異。激素治療第28天，生存組IL-6及TNF-α水平均明顯低于死亡組(P＜0.05)。ACHBLF患者中IFN-γ及STAT1相關(guān)基因表達(dá)量與健康對

19、照相比均有不同程度上升，并在激素治療3天出現(xiàn)明顯下降，在第28天下降均超過30％。
　　4.SOCS1表達(dá)水平與MELD積分在激素治療前、后均存在明顯的負(fù)相關(guān)性。
　　5.激素治療前，ACHBLF患者TBIL水平明顯高于健康對照(P＜0.05)，PTA水平明顯低于健康對照;ACHBLF患者生存組與死亡組TBIL及PTA水平無明顯差別(P＞0.05)。激素治療第28天，生存組患者TBIL水平明顯下降，PTA明顯上升;而死亡組無

20、明顯改善。在90天隨訪結(jié)束時(shí)采用激素治療的ACHBLF患者死亡率為52.3％。采用小樣本生存率估計(jì)(Kaplan-Meier法)對最初存在甲基化及無甲基化的患者分別進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)激素治療能夠明顯提高SOCS1非甲基化患者的生存率(P＜0.05)。
　　6.激素治療前有34％的ACHBLF患者存在SOCS1基因的甲基化情況，而30例健康對照中均未發(fā)現(xiàn)SOCS1啟動子區(qū)的甲基化。激素治療第3天MSP檢測ACHBLF患者未發(fā)現(xiàn)甲基化

21、狀態(tài)明顯改變，激素治療第28天檢測發(fā)現(xiàn)，8名最初存在SOCS1基因啟動子甲基化的患者未檢測到SOCS1的甲基化狀態(tài)，其中全部6名最初存在甲基化的生存組患者中有5人出現(xiàn)去甲基化，而10例死亡組患者中僅有3例出現(xiàn)了去甲基化情況。
　　結(jié)論
　　慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中，早期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素能夠明顯改善患者肝功能，提高SOCS1基因非甲基化者的生存率，而出現(xiàn)SOCS1甲基化的ACHBLF患者對糖皮質(zhì)激素治療效果反應(yīng)較差，死亡率明