慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及氧化損傷分析.pdf

1、第一部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析
　　 慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)急性肝功能失代償?shù)呐R床表現(xiàn)，主要由感染、酒精、肝毒性藥物等因素誘發(fā)，臨床表現(xiàn)為高膽紅素血癥、凝血功能障礙，并發(fā)腹水、肝性腦病和（或）肝腎綜合征以及多臟器功能衰竭等，全身血液動(dòng)力學(xué)改變伴隨ACLF的病情進(jìn)展，其病理生理過(guò)程包括全身炎癥反應(yīng)綜合征、炎

2、癥及氧化應(yīng)激等，死亡率極高。在我國(guó)，引起ACLF的首要病因是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，由慢性乙型病毒性肝炎所致的ACLF稱為慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronichepatitis B liver failure，ACHBLF)，是我國(guó)最常見(jiàn)的肝衰竭類(lèi)型，占80％～90％。在臨床上ACHBLF缺乏特異、有效的治療手段，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，絕大部分患者預(yù)后差。ACHBLF的發(fā)病機(jī)制尚

3、不完全明確。
　　 DNA甲基化是轉(zhuǎn)錄水平的DNA修飾方式之一，發(fā)生在CpG島上，它在調(diào)節(jié)基因表達(dá)及維持細(xì)胞正常分化中起著重要作用。目前認(rèn)為DNA甲基化可抑制基因表達(dá)。甲基化程度高，基因表達(dá)降低。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M3（glutath(i)one-S-transferase M3，GSTM3）是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases，GSTs)超家族一種重要的同工酶，具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激功能

4、，是機(jī)體內(nèi)抗氧化防御體系的重要成分之一，具備清除活性氧（或稱氧自由基）(reactive oxygen species，ROS)的能力。GSTM3基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化時(shí)可導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)，造成其抗氧化功能下降，ROS在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積，對(duì)肝臟的保護(hù)作用降低，可能會(huì)加重氧化損傷對(duì)肝功能的損害。
　　 基因啟動(dòng)子甲基化是目前研究的熱點(diǎn)，在惡性疾病的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)、治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷中，異常的DNA甲基化位點(diǎn)已

5、經(jīng)成為最有前景的分子標(biāo)志物之一。目前有關(guān)GSTs超家族成員GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化的研究多側(cè)重于與膀胱癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。我國(guó)肝癌患者中約90％有HBV感染背景，但目前尚未見(jiàn)對(duì)慢性乙型肝炎(chronichepatitis B，CHB)，特別是重型肝炎患者進(jìn)行該基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的研究。
　　 目的:
　　 本研究的目的是檢測(cè)ACHBLF患者是否存在GSTM3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化異常并通過(guò)比較

6、臨床預(yù)后相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)其臨床意義從而指導(dǎo)臨床應(yīng)用。
　　 方法:
　　 本研究采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，病例選自2009年12月至2011年2月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院住院及門(mén)診就診患者，其中ACHBLF組30例，CHB組30例;10名健康志愿者作為正常對(duì)照組。記錄以上研究對(duì)象的年齡、性別等指標(biāo)，收集肝功、腎功、凝血功能、HBV-DNA定量等臨床指標(biāo)并進(jìn)行比較。用試劑盒提取外周血DNA，并用重亞硫酸鹽法對(duì)其進(jìn)行甲基化修飾。應(yīng)用甲基

7、化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)方法檢測(cè)三組研究對(duì)象GSTM3基因的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)并進(jìn)行比較。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將ACHBLF組分為甲基化組和非甲基化組，計(jì)算各組的終末期肝病模型(model forend-stage liver disease，MELD)積分及死亡率，通過(guò)比較進(jìn)行臨床預(yù)后評(píng)價(jià)。
　　 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.

8、0 for Windows分析。組間臨床資料比較、MELD積分比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，甲基化率的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，死亡率比較應(yīng)用Fisher's確切概率法。P＜0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、ACHBLF組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)水平(516.110±527.137 IU/L)明顯高于CHB組(264.633±274.053 IU/L，P=0.0

9、24)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平(396.283±337.062 IU/L)明顯高于CHB組（212.153±222.816 IU/L，P=0.016），總膽紅素(total bilirubin，TBIL)水平(383.483±137.034μmol/L)明顯高于CHB組(37.400±27.004μmol/L，P＜0.001)，凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin time ac

10、tivity，PTA)水平(31.187±8.013％)明顯低于CHB組（90.000±9.766％，P＜0.001）。
　　 2、30例ACHBLF患者中9例檢測(cè)到GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化，比率為30％，30例CHB患者中2例檢測(cè)到GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化，比率為6.7％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.455，P=0.020)。
　　 3、ACHBLF患者甲基化組的血清TBIL水平(527.922±113.5

11、64μmol/L)明顯高于非甲基化組（321.581±93.048μmol/L，P＜0.001），PTA水平(24.811±10.697％)明顯低于非甲基化組(33.919±4.604％，P=0.035)。
　　 4、ACHBLF患者甲基化組的MELD積分(22.706±2.669)明顯高于非甲基化組(18.765±4.808，P=0.029)。ACHBLF患者有8人死亡，死亡率為26.7％，其中5人屬于甲基化組，死亡率為55.

12、6％，3人屬于非甲基化組，死亡率為14.3％，甲基化組的死亡率明顯高于非甲基化組(P=0.032)。
　　 結(jié)論:
　　 我們的研究結(jié)果首次表明ACHBLF患者存在GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化的異常，啟動(dòng)子甲基化可能導(dǎo)致GSTM3基因表達(dá)下降，抑制其抗氧化功能，加重氧化損傷程度，在CHB進(jìn)展為ACHBLF的過(guò)程中可能具有重要作用，檢測(cè)該基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可作為判斷ACHBLF患者預(yù)后的重要指標(biāo)。
　　 第二部分慢

13、加急性乙型肝炎肝衰竭患者GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性分析
　　 氧化應(yīng)激是機(jī)體的氧化能力與抗氧化能力失衡，氧化程度超出氧化物質(zhì)的清除能力，導(dǎo)致活性氧（或稱氧自由基）(reactive oxygen species，ROS)在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的細(xì)胞毒性，最終導(dǎo)致組織損傷的過(guò)程。氧化應(yīng)激可直接或間接引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶和DNA的氧化或損傷，誘發(fā)基因突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過(guò)氧化，與腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病、

14、各種肝?。òú《拘愿窝?、肝纖維化、肝癌）等多種疾病密切相關(guān)。肝臟含有豐富的線粒體，是ROS攻擊的主要器官。線粒體呼吸鏈復(fù)合體利用電子傳遞生產(chǎn)三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate, ATP)，是ROS的主要來(lái)源。氧化損傷可以加快肝臟病變的進(jìn)展。
　　 慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是多種因素參與的復(fù)雜過(guò)程，炎癥和氧化應(yīng)激在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。肝病時(shí)

15、患者體內(nèi)免疫功能紊亂，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，免疫復(fù)合物形成，補(bǔ)體活化及膠原纖維形成等均可刺激ROS生成增多，可引起肝細(xì)胞過(guò)氧化脂質(zhì)形成。機(jī)體內(nèi)ROS生成與清除處于失平衡狀態(tài)持續(xù)時(shí)間越久，組織細(xì)胞抗氧化防御保護(hù)功能越弱，肝損傷程度越重。
　　 肝細(xì)胞氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，形成過(guò)氧化產(chǎn)物如丙二醛(malondialdehyde，MDA)、酮類(lèi)、羥氫氧基等。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要代謝產(chǎn)物，是研究脂質(zhì)過(guò)氧化并反映氧化損傷的重要生物標(biāo)

16、志物，體內(nèi)MDA水平增高，提示存在氧化損傷;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)是一種抗氧化酶，它可修復(fù)ROS損傷的膜磷脂、抑制微粒體過(guò)氧化反應(yīng)等，通過(guò)多種方式起到抗氧化作用。肝細(xì)胞受損時(shí)GST可以快速釋放入血，血清GST活性測(cè)定是一項(xiàng)理想的反映肝細(xì)胞損害程度的指標(biāo)，具有良好的特異性和敏感性。二者的水平變化可反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除這一動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。
　　 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶M3（

17、glutathione-S-transferase M3，GSTM3）基因表達(dá)的改變會(huì)影響GST的抗氧化功能。我們第一部分的研究結(jié)果首次表明慢加急性乙型肝炎肝衰竭（acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF）患者存在GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化的異常，啟動(dòng)子甲基化可能導(dǎo)致GSTM3基因表達(dá)下降，抑制其抗氧化功能，加重氧化損傷程度，在慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB，

18、CHB)進(jìn)展為ACHBLF的過(guò)程中可能具有重要作用，檢測(cè)該基因啟動(dòng)子甲基化可作為判斷ACHBLF患者預(yù)后的重要指標(biāo)。
　　 目的:
　　 本研究的目的是通過(guò)檢測(cè)血清MDA和GST表達(dá)水平，并與終末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)積分進(jìn)行相關(guān)分析，探討ACHBLF患者GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與氧化應(yīng)激的關(guān)系，從而對(duì)ACHBLF的病情發(fā)展、評(píng)估預(yù)后及臨床治療提供

19、理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chainreaction，MSP)檢測(cè)GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，具體方法同實(shí)驗(yàn)第一部分，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)技術(shù)檢測(cè)CHB患者、ACHBLF患者血清MDA及GST的表達(dá)水平，并對(duì)ACHBLF患者進(jìn)行MDA、

20、GST水平與MELD積分的相關(guān)性分析。
　　 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0 for Windows分析。組間MDA及GST水平的比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman's檢驗(yàn)進(jìn)行MDA、GST水平與MELD積分的相關(guān)性分析。P＜0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、ACHBLF組的血清MDA水平(13.045±5.416 pmol/mg)明顯高于CHB組（9.387±5.33

21、2 pmol/mg,P=0.011）。
　　 2、ACHBLF甲基化組的血清MDA水平(16.956±2.155 pmol/mg)明顯高于非甲基化組（11.369±5.553 pmol/mg，P＜0.001）。
　　 3、ACHBLF組的血清GST水平(1318.081±273.887 mIU/L)明顯高于CHB組（666.832±181.267mIU/L,P＜0.001）。
　　 4、ACHBLF甲基化組的血清

22、GST水平(1381.678±236.841mIU/L)與非甲基化組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1262.253±202.782mIU/L，P=0.170)。
　　 5、ACHBLF組的血清MDA水平與MELD積分呈正相關(guān)(r=0.588，P=0.001)，而血清GST水平與MELD積分無(wú)相關(guān)性(r=0.115，P=0.546)。
　　 結(jié)論:
　　 ACHBLF患者GSTM3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與氧化應(yīng)激存在相關(guān)性，