慢性乙型肝炎與慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者TACE甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 慢性乙型肝炎患者TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)呈世界性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約有20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化及原發(fā)性肝癌。HBV感染對(duì)人類健康造成了很大的威脅，如何控制疾病進(jìn)展及清除病毒一直是研究熱點(diǎn)。在乙型肝炎病毒感染

2、的進(jìn)展中，e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換是一個(gè)至關(guān)重要的步驟。在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者中，HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換意味著臨床好轉(zhuǎn)，肝病進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定期，肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生率降低。然而，到目前為止，尚沒有可有效預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的敏感分子生物學(xué)指標(biāo)。
　　DNA甲基化是轉(zhuǎn)錄水平的DNA修飾方式之一，主要發(fā)生在CpG島上，它是由DNA甲基化酶

3、介導(dǎo)的化學(xué)修飾過程，在此過程中DNA序列5'CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上共價(jià)結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，見于基因的5'-CG-3'序列，甲基化形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育等許多重要的生物學(xué)過程。目前認(rèn)為，某些特定位點(diǎn)的DNA甲基化修飾方式可以作為臨床疾病評(píng)估的分子標(biāo)志物，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和原發(fā)性

4、肝癌等，在疾病診斷和臨床預(yù)警等方面，具有較高的敏感性和特異性。我們?cè)谇捌谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，某些基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，如GSTP1和GSTM3等基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，可以有效預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎和慢加急性肝衰竭的病情輕重。然而，DNA甲基化分子標(biāo)志物診斷乙型肝炎病情輕重和疾病預(yù)后的體系仍未完善，我們?nèi)孕枰獙ふ掖罅颗c疾病進(jìn)展密切相關(guān)的甲基化位點(diǎn)，用于指導(dǎo)臨床診斷和治療。
　　腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶（tumor necrosis factor

5、-α-converting enzyme，TACE）屬于解整合素和金屬蛋白水解酶(a disintegrin and metallopriteinases，ADAMs)家族，分子量為86KD，共包含824個(gè)氨基酸，其晶體結(jié)構(gòu)分析顯示TACE由多區(qū)域的細(xì)胞外部分（包括信號(hào)肽、催化前區(qū)、259個(gè)氨基酸殘基的催化區(qū)和半胱氨酸富含區(qū)組成）、穿膜螺旋段和胞漿內(nèi)段組成。TACE具有蛋白水解酶活性，可裂解多種跨膜蛋白，釋放出有活性的可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域

6、，可通過多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)參與肝臟炎癥損傷。鑒于此，我們推測(cè)，TACE基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可能參與的慢性乙型肝炎的發(fā)展過程，并有可能作為一個(gè)新的分子標(biāo)志物，用于疾病診斷。在本研究中，我們重點(diǎn)探討了TACE啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)是否參與了慢性乙型肝炎的發(fā)病過程，并判斷TACE啟動(dòng)子甲基化能否作為分子標(biāo)志物用于HBeAg狀態(tài)的潛在價(jià)值。
　　目的:
　　本研究的目的是通過檢測(cè)及比較HBeAg陽性及陰性CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)

7、胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，并探討慢性乙型肝炎患者中TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的臨床價(jià)值。
　　方法:
　　隨機(jī)選取80例HBeAg陽性CHB患者、80例HBeAg陰性CHB患者和40例健康對(duì)照者(healthy controls，HCs)為研究對(duì)象。記錄以上研究對(duì)象的年齡、性別等指標(biāo)，收集肝功、腎功、HBeA定量、HBV DNA

8、定量等臨床指標(biāo)。提取其PBMCs基因組DNA，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specificpolymerase chain reaction，MSP-PCR)法檢測(cè)各組TACE基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1、CHB組中TACE基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率(130/160，81.25％)明顯低于HCs組(38/40，95％)，二者間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.501，P＜0.05)。

9、>　　2、HBeAg陽性CHB組的TACE基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率(58/80，72.5％)明顯低于HBeAg陰性CHB組（72/80，90％;x2=8.041，P＜0.01）和HCs組(x2=8.438，P＜0.01)。而HBeAg陰性CHB組和HCs組的TACE基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=0.873，P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　我們的研究結(jié)果表明在HBeAg陽性CHB中存在著TACE基因啟動(dòng)子區(qū)

10、的異常低甲基化，且其甲基化率與血清HBeAg的水平呈明顯負(fù)相關(guān)。因此，TACE啟動(dòng)子區(qū)的甲基化或許可作為HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的生物標(biāo)志物。
　　第二部分 慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究
　　肝衰竭是臨床常見的嚴(yán)重疾病癥候群，病死率極高。它是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致肝臟的合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙甚至失代償，出現(xiàn)黃疸、凝血功能障礙、腹水以及肝性腦病等各種臨床表現(xiàn)。根據(jù)

11、病理組織學(xué)特征及病情發(fā)展速度，肝衰竭被分為四類:急性肝衰竭、亞急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭。慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)上，短期內(nèi)發(fā)生的亞急性肝功能失代償?shù)呐R床癥候群。在我國，引起ACLF的首要病因是HBV感染，在慢性乙型肝炎基礎(chǔ)上發(fā)生的ACLF稱為慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failu

12、re，ACHBLF)，是我國最常見的肝衰竭類型，占所有肝衰竭數(shù)量的80％～90％。在臨床上ACHBLF缺乏特異、有效的治療手段，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，絕大部分患者預(yù)后差。
　　目前為止，ACHBLF的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。先前的研究表明，TNF-α、可溶性TNFRⅠ（sTNFRⅠ）和sTNFRⅡ在ACHBLF的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。在大多數(shù)炎癥機(jī)制中，TNF-α的功能主要是增強(qiáng)細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和組織破壞。TACE是

13、ADAM家族中的一員，能水解TNF-α前體及TNFR成為可溶性TNF-α、sTNFR。到目前為止，關(guān)于TACE與ACHBLF發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究較少。
　　基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是目前研究的熱點(diǎn)。在惡性疾病的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)、治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷中，異常的DNA甲基化位點(diǎn)已經(jīng)成為最有前景的分子標(biāo)志物之一。為了進(jìn)一步探討TACE在肝衰竭發(fā)生、發(fā)展中的作用，我們研究了TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與ACHBLF的關(guān)系。

14、>　　目的:
　　本研究的目的是通過檢測(cè)ACHBLF患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)的TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，進(jìn)一步探討TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在ACHBLF患者發(fā)病機(jī)制中的作用及對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　方法:
　　隨機(jī)選取45例ACHBLF患者、80例CHB患者和54例HCs作為研究對(duì)象。記錄所有研究對(duì)象的年齡、性別等基本臨床指標(biāo)，收集以

15、上研究對(duì)象的肝功、凝血、腎功、HBeAg定量、HBV-DNA定量等實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。提取其外周血PBMCs基因組DNA、RNA及血漿，采用MSP-PCR法檢測(cè)各組PBMCs中TACE基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime-polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測(cè)各組PBMCs中TACE mRNA表達(dá)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzyme-linked

16、 immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)各組血漿TACE，TNF-α，sTNFRⅠ及sTNFRⅡ的表達(dá)水平。ACHBLF患者至少隨訪三個(gè)月并記錄其預(yù)后。
　　結(jié)果:
　　1、ACHBLF組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)水平明顯高于C

17、HB組及HCs組(P＜0.05)，血漿凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin timeactivity，PTA)水平明顯低于CHB組及HCs組（P＜0.05）。
　　2、45例ACHBLF患者中16例檢測(cè)到TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，比率為35.56％，80例CHB患者中64例檢測(cè)到TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，比率為80％，54例HCs組中有50例檢測(cè)到TACE基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，比率為92.59％。ACHBLF患者組的TACE甲