轉(zhuǎn)基因白樺微繁過(guò)程中DNA甲基化的變異機(jī)制.pdf

1、本文選取不同整合方式的轉(zhuǎn)基因白樺無(wú)性系,以其微繁過(guò)程中不同發(fā)育階段(腋芽、幼嫩愈傷組織、老化愈傷組織、出芽愈傷、再生芽、根)及特殊狀態(tài)愈傷組織(花藥愈傷組織、紅斑狀愈傷組織、木質(zhì)化愈傷)作為研究材料。測(cè)定其POD、SOD、CAT、木質(zhì)素、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛等生理生化指標(biāo)。利用甲基化敏感多態(tài)性(methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)檢測(cè)微繁過(guò)程中DNA甲基化水平和模式

2、的變化。以酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)測(cè)定甲基轉(zhuǎn)移酶活性的變化,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因(DRM和MET,DRM是重頭甲基化酶(de novomethyltransferases)的基因,MET是維持甲基化酶(maintenance methyltransferase)的基因)及外源基因(BGT)的表達(dá)水平。從而揭示微繁再生過(guò)程中的DNA甲基化變異機(jī)制。所得結(jié)果如下:
　　 1.微繁過(guò)程中(脫分化和再分化),P

3、OD、SOD和CAT三個(gè)保護(hù)酶活性、可溶性糖含量、呈先升高(1～2倍)后降低(0.3～0.7倍)趨勢(shì),而木質(zhì)素和可溶性糖呈先降低后升高趨勢(shì)。老化愈傷組織保護(hù)酶活性、可溶性糖降低僅為幼嫩愈傷組織的0.2～0.4倍。愈傷組織老化階段保護(hù)酶活性、木質(zhì)素和可溶性總蛋白含量顯著降低(0.3～0.7倍),。MDA含量升高(1.5倍)。
　　 2.DNA甲基化水平分析表明,微繁過(guò)程中不同階段的轉(zhuǎn)基因Tp46號(hào)株系為9.93％～14.77％,轉(zhuǎn)

4、基因Tp74號(hào)株系為13.33％～21.22％,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?CK)為11.92％～17.03％,3個(gè)無(wú)性系變化趨勢(shì)相似,在微繁過(guò)程中(脫分化和再分化),呈先降低后升高的趨勢(shì),平均值由13.62％下降至11.89％,又上升至13.42％,腋芽誘導(dǎo)形成愈傷組織階段主要發(fā)生去甲基化,其MSAP模式變化以出現(xiàn)新條帶為主(64.52％～92.59％)。再生芽誘導(dǎo)生根階段,DNA甲基化平均值由14.70％升高到16.79％,MSAP模式以條帶消失

5、為主(79％)。老化愈傷組織DNA甲基化平均值(15.06％)高于幼嫩愈傷組織(11.89％),其MSAP模式變化以條帶消失為主(55.56％)。紅斑狀愈傷組織和木質(zhì)化愈傷組織甲基化水平略高于幼嫩愈傷組織。MSAP模式中內(nèi)外側(cè)甲基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)換頻率最低,幼嫩愈傷組織形成再生芽過(guò)程最高僅為6.85％。
　　 3.甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá),微繁過(guò)程(脫分化和再分化),除Tp46號(hào)MET基因表達(dá)含量升高外,3個(gè)無(wú)性系兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)都降低

6、,最低僅為腋芽的0.06倍,愈傷組織形成再生芽過(guò)程中,甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)水平升高,最高為腋芽的6.73倍。特殊狀態(tài)愈傷組織甲基轉(zhuǎn)移酶活性均高于幼嫩愈傷組織,最高老化愈傷組織為幼嫩愈傷的20倍。
　　 4.外源基因表達(dá),在微繁過(guò)程(脫分化和再分化)外源基因表達(dá)先升高后降低,升高倍數(shù)約為1.2倍,生根過(guò)程外源基因表達(dá)顯著降低,根中僅為腋芽的0.36倍。老化愈傷組織、花藥愈傷組織的外源基因表達(dá)水平低于幼嫩愈傷,約為幼嫩愈傷組織的0.6