TCDD誘導(dǎo)胎鼠腭裂發(fā)生過程中DNA甲基化變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 TCDD誘導(dǎo)C57BL/6J胎鼠腭裂的最適劑量再探討
　　目的：
　　觀察不同劑量環(huán)境污染物2,3,7,8-四氯二苯二噁英（2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）誘導(dǎo)的C57BL/6J胎鼠腭部發(fā)育情況及死胎發(fā)生，探討腭裂發(fā)生率和死胎發(fā)生率與TCDD劑量的相關(guān)性。
　　方法：
　　于合籠交配后第10.5天（GD10.5），將判斷受孕并稱重的C57BL/6J孕鼠分

2、為不同劑量給藥組給予0、8、18、28μg/kg的TCDD。觀察孕鼠活動情況至GD17.5，處死孕鼠，剖腹取胎，觀察死胎發(fā)生情況。于解剖顯微鏡下觀察存活胚胎腭部發(fā)育情況。
　　結(jié)果：
　　對照組與實(shí)驗(yàn)組在孕鼠體重增加、每窩胚胎數(shù)上無差異(P＜0.05)，各劑量組產(chǎn)生的腭裂表型無差異。對照組無腭裂及死胎發(fā)生。各劑量組腭裂發(fā)生率均顯著高于對照組（P＜0.01）；但 TCDD18μg/kg和28μg/kg組間腭裂發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

3、（P＞0.05）；僅TCDD28μg/kg組與更低劑量組及對照組的死胎發(fā)生率存在差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　TCDD20μg/kg～30μg/kg劑量區(qū)間是誘導(dǎo)腭裂高發(fā)生率的平臺區(qū)間，即為誘導(dǎo)C57BL/6J胎鼠腭裂高發(fā)生率的最適劑量。
　　第二部分腭發(fā)育過程中基因組DNA甲基化的初步研究
　　目的:
　　研究TCDD作用于C57BL/6J孕鼠后，胎鼠腭組織基因組DNA甲基化水平變化及正向調(diào)控甲

4、基化水平的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltranferases，Dnmts）和負(fù)向調(diào)控甲基化水平的十-十一轉(zhuǎn)位蛋白（Ten-Eleven Translocations，TETs）mRNA的表達(dá)情況，明確基因組DNA甲基化在腭發(fā)育過程中的作用。
　　方法:
　　C57BL/6J孕鼠共40只，隨機(jī)分為TCDD組和對照組，每組20只。TCDD組于受孕后第10.5天（gestation day，GD10.5）以TCDD28μ

5、g/kg一次性灌胃；對照組以等量玉米油一次性灌胃；分別于GD13.5、GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5處死孕鼠，收集各時(shí)間點(diǎn)的胎鼠腭組織，分別提取基因組DNA、總RNA。應(yīng)用MethylampT.M.基因組DNA甲基化定量試劑盒檢測基因組DNA甲基化水平,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b以及TET1、TET2、TET3 mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　TCDD組標(biāo)準(zhǔn)化甲基

6、化率在GD13.5顯著高于對照組組（P＜0.01）；而在GD14.5、16.5均低于對照組（P＜0.05，P＜0.05）。在GD13.5、16.5，TCDD組Dnmt1 mRNA表達(dá)量高于對照組（P＜0.05，P＜0.01）。在GD13.5、16.5，TCDD組Dnmt3a mRNA表達(dá)量高于對照組（P＜0.05，P＜0.05）。在GD14.5，TCDD組Dnmt3b mRNA表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.01）。在GD13.5，TCD

7、D組TET3 mRNA表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.01）。
　　結(jié)論：胎鼠腭組織內(nèi)可能存在復(fù)雜的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。由Dnmt1、Dnmt3a表達(dá)升高以及 TET3表達(dá)降低引起的腭組織GD13.5基因組DNA甲基化水平的顯著升高可能是TCDD致胎鼠腭發(fā)育障礙的表觀遺傳機(jī)制之一。
　　第三部分 TGF-β3、Dnmt1、Dnmt3a基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　探討TGF-β3、Dn

8、mts基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)與TCDD所致胎鼠腭發(fā)育障礙的相關(guān)性。
　　方法：
　　將已知孕期的C57BL/6J孕鼠共18只，隨機(jī)分為TCDD組和對照組。TCDD組于GD10.5給予28μg/kg的TCDD，對照組給予等體重體積的玉米油。分別于GD13.5、14.5、15.5處死孕鼠，收集各組胎鼠腭突組織。通過試劑盒提取組織DNA、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、甲基化特異性PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析各組各時(shí)間點(diǎn)腭組織

9、表達(dá)的TGF-β3、Dnmts啟動子CpG島甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　各組各時(shí)間點(diǎn)TGF-β3啟動子區(qū)CpG島均處于低甲基化水平，相同時(shí)間點(diǎn)兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Dnmt1啟動子區(qū)CpG島均處于高甲基化水平，相同時(shí)間點(diǎn)兩組間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。TCDD組Dnmt3a啟動子區(qū)CpG島1的甲基化水平在GD13.5和GD15.5高于對照組（P＜0.01，P＜0.01），在GD14.5低于對照組（P＜0