細(xì)胞復(fù)制性衰老及H-,2-O-,2-誘導(dǎo)的衰老過程中DNA甲基化的改變.pdf

1、按照聯(lián)合國的標(biāo)準(zhǔn)，60歲以上的人口超過10﹪就進(jìn)入了老齡化社會(huì)，2005年統(tǒng)計(jì)，中國60歲以上人口是1.44億，占全國人口的11﹪。因此，中國已經(jīng)進(jìn)入了老齡化社會(huì)。眾所周知，老年人由于身體組織結(jié)構(gòu)逐步老化，器官功能障礙，身體抵抗力減弱，活動(dòng)度降低以及協(xié)同功能喪失等多種原因，容易發(fā)生老年病如老年性精神病、老年性癡呆、老年性耳聾、腫瘤、高血壓、心血管疾病等；而且老年人的患病率和患病時(shí)間平均是一般人的2-3倍。如何減少老年人的發(fā)病率和提高老年

2、人的生活質(zhì)量，是目前中國面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。這個(gè)問題的解決在依靠政府重視，增加資金投入的同時(shí)，也離不開衰老的相關(guān)研究。 近十幾年來，衰老機(jī)制的研究是當(dāng)今生命科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，也取得了一些進(jìn)展。目前成熟的假說有遺傳決定學(xué)說、氧化損失學(xué)說(即自由基一線粒體理論)、衰老分化障礙學(xué)說(dys-differentiation hypothesis ofaging)、端粒一端粒酶學(xué)說、衰老基因?qū)W說<'[1-4]>等等。衰老機(jī)制的探討有

3、助于老年性疾病的診斷和治療，也為預(yù)防老年病提供重要的依據(jù)。 既往的衰老機(jī)制研究從遺傳角度考慮較多，表觀遺傳學(xué)(epigenetic)是與遺傳學(xué)(genetic)相對(duì)應(yīng)的概念。遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等。隨著2001年2月15日人類基因組全序列草圖的基本完成，人類表基因組計(jì)劃在2

4、003年正式啟動(dòng)，該計(jì)劃目的是繪制DNA上所有的甲基化位點(diǎn)，建立控制基因活性的主要化學(xué)變化圖譜。這個(gè)聯(lián)盟已經(jīng)完成了與組織相容性復(fù)合物相關(guān)的1，000，000個(gè)甲基化標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)6號(hào)染色體有一部分與許多疾病相關(guān)。這是世界上首項(xiàng)針對(duì)控制人類基因“開”和“關(guān)”的主要成分進(jìn)行的圖譜繪制工作，將有助于科學(xué)家建立人類遺傳、疾病和環(huán)境之間的關(guān)鍵聯(lián)系<'[5]>。關(guān)于表遺傳調(diào)節(jié)的一種最主要形式是DNA上胞嘧啶的甲基化，從而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。

5、現(xiàn)在已經(jīng)清楚表明DNA甲基化在基因沉默、X染色體滅活、遺傳印記以及胚胎發(fā)育過程等方面起關(guān)鍵作用。有關(guān)DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系研究在近些年來有多種發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織整體基因組低甲基化和抑癌基因的高甲基化相伴隨；DNA甲基化參與基因的表達(dá)調(diào)控，啟動(dòng)子區(qū)高甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄、低甲基化使基因過表達(dá)等等，這些為臨床診斷和治療腫瘤開辟了新的天地，例如通過去甲基化藥物降低抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化來治療腫瘤已經(jīng)廣泛用于臨床。對(duì)于不同腫瘤如肺癌、乳腺癌、膀

6、胱癌、結(jié)腸癌等等與DNA甲基化之間的關(guān)系研究已經(jīng)很多，但是衰老與DNA甲基化的關(guān)系研究，在國外處于剛起步狀態(tài)，國內(nèi)研究就更少?；蚪M甲基化修飾是衰老的原因還是衰老的結(jié)果?甲基化修飾對(duì)衰老的作用是通過什么樣的途徑實(shí)現(xiàn)的?這種作用是間接還是直接的呢?這些問題都有待于深入探討。依據(jù)1965年HarmanD提出的自由基理論：隨齡體內(nèi)線粒體產(chǎn)生自由基增多，所致細(xì)胞和組織損傷增多，而DNA修復(fù)能力卻逐步減弱<'[6]>，有關(guān)氧化應(yīng)激與衰老關(guān)系的研究

7、逐步增加。目前最得到認(rèn)可的體外細(xì)胞衰老模型常用H<,2>O<,2>誘導(dǎo)人二倍體成纖維細(xì)胞來獲得<'[7]>。在氧化應(yīng)激致衰老過程中，基因P66<'shc>參與并起著非常重要的作用，P66<'shc>是近幾年才發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)壽基因，它參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)，在ROS信號(hào)反應(yīng)過程中，是一個(gè)很重要的接合蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)p66<'shc-/->小鼠對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力增強(qiáng)，且壽齡比野生型小鼠延長(zhǎng)30﹪；P66<'shc>?？梢哉T導(dǎo)永久性細(xì)胞周期停滯<'[8]>。

8、基因P66<'shc>在衰老過程的表達(dá)變化，報(bào)導(dǎo)結(jié)果不一。而胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)是目前發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的印記基因之一，對(duì)胚胎和個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，近年發(fā)現(xiàn)許多遺傳病尤其惡性腫瘤中都存在該基因的印記丟失所致的IGF2高表達(dá)現(xiàn)象，這些基因隨齡表達(dá)如何改變，啟動(dòng)子區(qū)甲基化的改變以及二者之間的關(guān)系?均有待于進(jìn)一步研究。 本研究旨在探討細(xì)胞復(fù)制性衰老及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)(過氧化氫染毒)的衰老與DNA甲基化的關(guān)系，主要內(nèi)容有：細(xì)胞衰

9、老過程中整體DNA甲基化改變、衰老相關(guān)基因P66<'shc>、印記基因IGF<,2>的啟動(dòng)子區(qū)甲基化的改變及其隨齡mRNA表達(dá)變化、DNMT1 mRNA表達(dá)及蛋白改變；不同劑量H<,2>O<,2>刺激細(xì)胞后，細(xì)胞上述指標(biāo)的影響。方法一、H<,2>O<,2>染毒劑量的確定培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞(HPF)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁24h后，換無血清培養(yǎng)基，使用不同濃度H<,2>O<,2>分別刺激細(xì)胞2h，用CCK-8試劑法分析細(xì)胞的增殖功能和毒性作用，

10、為后續(xù)實(shí)驗(yàn)短期染毒確定低、中、高三個(gè)染毒劑量。 結(jié)論 一、成功建立細(xì)胞衰老模型，確定衰老條件和標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)衰老機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。10μM、100μM和200μM H<,2>O<,2>短期染毒細(xì)胞后，沒有改變細(xì)胞壽齡，但影響不同年齡階段的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度。 二、衰老基因P66<'shc>，其mRNA表達(dá)可作為判斷衰老的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)指標(biāo)。 三、正常細(xì)胞衰老過程中，整體基因組甲基化水平隨齡逐漸降低，H<,2