PTEN對H-,2-O-,2-誘導的BK-,Ca-通道激活的調(diào)節(jié)研究.pdf

1、大電導鈣依賴性鉀通道（Large conductance calcium and voltage-dependentpotassium，BKCa通道）分布廣泛，受氧化、磷酸化、胞內(nèi)鈣濃度等因素的調(diào)節(jié)，在血管、神經(jīng)內(nèi)分泌等生理、病理過程中發(fā)揮重要的作用。過氧化氫（Hydrogen peroxide,H2O2）屬于活性氧（ROS）的重要成員，既是細胞損傷的因素，又是胞內(nèi)的第二信使。PTEN具有負調(diào)控PI3K的作用，能調(diào)節(jié)細胞的大小、生長、凋

2、亡、遷移等，是當前研究的熱點之一。本研究以膜片鉗技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合分子、細胞生物學技術(shù)，從H2O2對BKCa通道的作用，PTEN對H2O2誘導的BKCa通道激活的作用和PTEN磷脂酶活性對H2O2誘導的BKCa通道激活的調(diào)節(jié)等三個方面闡釋PTEN、BKCa通道和H2O2之間的相互關(guān)系，旨在闡明H2O2激活BKCa通道、舒張血管的分子機制，為進一步探索氧化誘發(fā)的心血管疾病機制提供基礎(chǔ)。
　　 本文以鼠源BKCa通道α亞基（Slo）基

3、因（mSlo）在HEK 293細胞表達，運用inside-out和cell-attached 兩種不同的膜片鉗記錄模式檢測BKCa通道電流，研究H2O2對BKCa通道的作用。在inside-out模式下，發(fā)現(xiàn)以0 μmol Ca2+電極外液灌流時H2O2能明顯抑制BKCa通道電流，且DTT對抑制的電流有部分恢復(fù)作用。而以10 μmol Ca2+電極外液灌流時，H2O2、DTT對BKCa通道電流均無明顯作用。說明H2O2對BKCa通道的作

4、用主要依靠氧化還原效應(yīng)影響通道對Ca2+的敏感性。在cell-attached模式下，我們發(fā)現(xiàn)H2O2能顯著、快速增強BKCa通道活性，表明H2O2刺激BKCa通道能產(chǎn)生兩種完全不同的作用。而巰基特異性的氧化劑DTNB在兩種模式下均抑制BKCa通道活性，說明在cell-attached模式下H2O2和DTNB對BKCa通道的作用機制不同。H2O2對BKCa通道的影響受作用方式和H2O2濃度的影響。
　　 為了研究PTEN在H2O

5、2激活BKCa通道電流中的作用，我們構(gòu)建了PTEN-Tdimer2的嵌合基因克隆表達質(zhì)粒。通過將PTENwt與mSlo或mSlo和hβ1 在HEK 293細胞共轉(zhuǎn)染，在cell-attached模式下記錄BKCa通道電流，發(fā)現(xiàn)在PTENwt過表達的細胞上，不管有無β1的表達，H2O2刺激初始10 min都不會明顯增加BKCa通道的活性。此結(jié)果不僅說明PTEN能抑制H2O2誘導的BKCa通道激活，而且證實β1 亞基的存在并不影響PTEN的

6、作用。進一步以PI3K抑制劑LY294002 或Wortmannin孵育細胞，在cell-attached模式下記錄電流，發(fā)現(xiàn)H2O2刺激初始10 min也并不明顯增強BKCa通道活性，說明PI3K參與了H2O2誘導的BKCa通道激活過程。為進一步闡明PI3K/PTEN通路對H2O2誘導BKCa通道激活的生理、病理學意義，我們觀測了LY294002對H2O2誘導的血管舒張的作用，發(fā)現(xiàn)LY294002 能明顯抑制H2O2誘導的血管舒張，但

7、當BKCa通道阻斷劑Iberiotoxin存在時，LY294002的抑制作用消失，說明PI3K是通過BKCa通道的調(diào)節(jié)參與H2O2誘導的血管環(huán)舒張作用。
　　 為了進一步闡明PTEN對H2O2激活BKCa通道的抑制作用機制，將mSlo與磷脂酶活性缺失的PTENC124S或PTENG129E在細胞共表達，發(fā)現(xiàn)H2O2誘導的BKCa通道激活并沒有被抑制，說明PTEN對H2O2誘導的BKCa通道激活的抑制作用主要是通過其磷脂酶活性實現(xiàn)

8、的。針對PTEN蛋白的磷脂酶活性，我們應(yīng)用Western Blot分析了H2O2刺激PTENwt、PTENC124S、PTENG129E過表達細胞產(chǎn)生的p-AKT表達變化，發(fā)現(xiàn)H2O2刺激初期并不影響PTEN對p-AKT表達的抑制作用，但是在刺激30 min后p-AKT的表達增加，可能與H2O2對PTEN的氧化有關(guān)。通過激光共聚焦掃描顯微鏡檢測H2O2刺激PTENwt、PTENC124S、PTENG129E過表達細胞后胞內(nèi)鈣濃度變化，發(fā)