1、CRH對(duì)不同狀態(tài)妊娠子宮肌BK-,Ca-表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;2、H-,2-S合成酶及K-,ATP-通道在不同狀態(tài)妊娠子宮肌的表達(dá).pdf

1、研究表明，啟動(dòng)分娩的許多信號(hào)可通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道進(jìn)而改變子宮平滑肌的舒縮狀態(tài)使得子宮興奮。大電導(dǎo)鈣離子激活的鉀通道(BKCa)，作為在子宮肌上表達(dá)量最高的鉀離子通道在調(diào)控子宮肌的收縮性方面起重要作用。研究表明，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)及其相關(guān)肽可通過(guò)CRH-R1和CRH-R2兩種不同亞型的受體介導(dǎo)的作用，調(diào)節(jié)子宮肌的舒縮狀態(tài)，進(jìn)而參與妊娠和分娩的諸多環(huán)節(jié)。然而其作用的具體靶點(diǎn)目前還不是很清楚。因此在本課題的第一部分，我們以原代培

2、養(yǎng)的臨產(chǎn)和未臨產(chǎn)子宮平滑肌細(xì)胞為模型，使用CRHR1和CRHR2的特異受體拮抗劑antalarmin和astressin2B、廣譜受體拮抗劑astressin，研究了子宮肌不同狀態(tài)下內(nèi)源性CRH通過(guò)CRHR1和CRHR2介導(dǎo)的對(duì)BKCa的調(diào)節(jié)作用；并且通過(guò)給予外源性的CRH，進(jìn)一步叨確了CRH通過(guò)不同受體介導(dǎo)的調(diào)節(jié)BKCa的綜合作用。
　　 妊娠末期分娩的啟動(dòng)機(jī)制極其復(fù)雜，體內(nèi)各類(lèi)激素水平、收縮相關(guān)蛋白表達(dá)量及其他因素的改變共同

3、作用進(jìn)而啟動(dòng)分娩的進(jìn)程，其中氣體信號(hào)分子的作用逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。已有研究表明，NO和CO能通過(guò)GC-cGMP途徑舒張子宮平滑肌，參與其靜息狀態(tài)的維持。H2S作為第三類(lèi)氣體信號(hào)分子，可通過(guò)激活A(yù)TP敏感的鉀離子通道(KATP)舒張血管平滑肌，但目前對(duì)其在子宮肌上的表達(dá)和功能了解還很有限。因此在本課題的第二部分中，我們對(duì)內(nèi)源性血管舒張因子H2S及其下游靶分子KATP通道是否參與妊娠及分娩展開(kāi)研究，著重研究了不同狀態(tài)子宮肌中H2S合成相關(guān)酶C

4、BS和CSE的表達(dá)；并測(cè)定其合成H2S的速率，進(jìn)一步研究H2S對(duì)不同狀態(tài)子宮平滑肌的調(diào)節(jié)作用以及KATP構(gòu)成亞基在不同狀態(tài)子宮平滑肌中mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 一、CRH通過(guò)不同受體對(duì)妊娠子宮平滑肌細(xì)胞上BKCa的調(diào)節(jié)作用
　　 1.免疫組化發(fā)現(xiàn)，子宮平滑肌組織中存在內(nèi)源性CRH的表達(dá)。
　　 2.放射性免疫方法測(cè)定原代培養(yǎng)的臨產(chǎn)狀態(tài)子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性CRH的分泌量要高于未

5、臨產(chǎn)狀態(tài)子宮平滑肌細(xì)胞。
　　 3.分別使用CRHR1的特異性拮抗劑antalarmin和CRHR2的特異性拮抗劑astressin2B處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在未臨產(chǎn)子宮平滑肌細(xì)胞上，antalarmin下調(diào)BKCa核心α亞基和調(diào)節(jié)β亞基的mRNA和蛋白表達(dá)，astressin2B上調(diào)兩種亞基的mRNA和蛋白表達(dá)；在臨產(chǎn)子宮平滑肌細(xì)胞上，antalarmin上調(diào)α亞基和β亞基的mRNA和蛋白的表達(dá)，astressin2B下調(diào)α亞基的mR

6、NA和蛋白的表達(dá)，但對(duì)β亞基的表達(dá)沒(méi)有明顯調(diào)節(jié)作用。并且兩種特異性拮抗劑的對(duì)α亞基和β亞基調(diào)節(jié)作用在未臨產(chǎn)及臨產(chǎn)子宮肌細(xì)胞上存在劑量依賴(lài)效應(yīng)及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。
　　 4.使用外源性CRH處理子宮平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在未臨產(chǎn)子宮平滑肌細(xì)胞上α亞基和β亞基的mRNA和蛋白表達(dá)均呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性增加；在臨產(chǎn)子宮肌細(xì)胞上，α亞基和β亞基的mRNA和蛋白表達(dá)減少，亦存在劑量及時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。
　　 5.在未臨產(chǎn)子宮肌細(xì)胞上，外源性

7、CRH對(duì)α亞基和β亞基表達(dá)的上調(diào)作用，可以被CRHR1的特異性拮抗劑antalarmin完全阻斷，不能被CRHR2的特異性拮抗劑astressin2B阻斷，可被受體廣譜拮抗劑astressin部分阻斷。這表明外源性CRH在未臨產(chǎn)子宮肌上通過(guò)不同受體介導(dǎo)的作用不盡相同，但主要通過(guò)CRHR1增加BKCa的α亞基和β亞基的表達(dá)。在臨產(chǎn)子宮肌細(xì)胞上，外源性CRH對(duì)α亞基表達(dá)的下調(diào)作用，可被antalarmin完全阻斷，不能被astressin2

8、B阻斷，可被astressin部分阻斷。而β亞基表達(dá)受外源性CRH下調(diào)的趨勢(shì)，只能被antalarmin和astressin部分阻斷。這表明在臨產(chǎn)子宮平滑肌上，外源性CRH是通過(guò)CRHR1介導(dǎo)的作用，下調(diào)了BKCa的表達(dá)。
　　 6.利用RNA干擾技術(shù)使原代培養(yǎng)的未臨產(chǎn)子宮肌細(xì)胞CRHR1及CRHR2分別表達(dá)減少。在此模型上觀察到，CRH可下調(diào)si-CRHR1轉(zhuǎn)染的未臨產(chǎn)子宮肌細(xì)胞上BKCa的表達(dá)，該作用可被CRHR2特異性阻斷

9、劑逆轉(zhuǎn)；CRH對(duì)si-CRHR2轉(zhuǎn)染的子宮肌細(xì)胞上BKCa的表達(dá)具反方向調(diào)節(jié)作用。這一結(jié)果證實(shí)未臨產(chǎn)子宮平滑肌上CRH通過(guò)CRHR1介導(dǎo)對(duì)BKCa的表達(dá)的上調(diào)作用，CRHR2介導(dǎo)的作用與之相反。
　　 二、不同狀態(tài)妊娠子宮平滑肌中H2S合成相關(guān)酶和KATP通道的表達(dá)
　　 1.免疫組化證實(shí)在子宮平滑肌組織上存在H2S兩種合成相關(guān)酶CBS和CSE的表達(dá)。
　　 2.臨產(chǎn)狀態(tài)的子宮平滑肌下段中CBS的mRNA和蛋白表

10、達(dá)量均比未臨產(chǎn)狀況明顯下降，而CSE只存在mRNA水平上表達(dá)量下調(diào)，蛋白水平表達(dá)沒(méi)有明顯變化。表明子宮平滑肌CBS表達(dá)量的改變可能導(dǎo)致內(nèi)源性H2S的生成量變化，而未臨產(chǎn)子宮肌下段中H2S合成酶較高的表達(dá)量與平滑肌靜息狀態(tài)的維持密切相關(guān)。
　　 3.極譜法實(shí)時(shí)測(cè)定不同狀態(tài)妊娠子宮肌下段中H2S合成酶生成H2S的速率，結(jié)果表明未臨產(chǎn)子宮肌中生成H2S速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨產(chǎn)子宮肌。提示由于H2S具有舒張平滑肌的作用，其高生成率亦可能是妊娠

11、期間維持子宮肌靜息狀態(tài)的影響因素之一。
　　 4.免疫組織化學(xué)的方法表明，構(gòu)成KATP通道的四種亞基(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)在子宮平滑肌上均有表達(dá)。
　　 5.熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在臨產(chǎn)子宮肌上兩種通道核心組成單位Kir6.1和Kir6.2的表達(dá)量比未臨產(chǎn)子宮肌上的表達(dá)量下降，而兩種調(diào)節(jié)組成單位SUR1和SUR2B表達(dá)并無(wú)明顯變化。在蛋白表達(dá)水平上，臨產(chǎn)狀態(tài)下的Kir6.1和Kir6.

12、2的表達(dá)量明顯減少，而SUR1的表達(dá)量上升，同時(shí)SUR2B的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。這說(shuō)叨KATP通道在不同狀態(tài)的子宮肌上主要是通過(guò)改變其核心組成單位的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)子宮平滑肌的靜息狀態(tài)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究表明，CRH通過(guò)其不同亞型受體介導(dǎo)的作用對(duì)子宮平滑肌中BKCa的表達(dá)起到相反的調(diào)節(jié)作用，但以CRHR1的作用為主，BKCa表達(dá)量的改變可能是CRH對(duì)子宮肌組織雙向調(diào)節(jié)作用的機(jī)制之一。此外，氣體信號(hào)分子H2S及其合成