竹類植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的DNA甲基化研究.pdf

1、為探究竹類植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表觀遺傳現(xiàn)象，采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）和高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對(duì)不同生理年齡的毛竹（Phyllostachys heterocycla var. pubescens）、開花與未開花的孝順竹（Bambusa. multiplex）、以及同一生理起源、不同生境下的黃稈烏哺雞竹（Ph.vivax f.aureocaulis）的幼嫩葉片進(jìn)行了基因組DNA甲基化檢測(cè)，得到如下結(jié)論：
　　1、毛

2、竹基因組DNA甲基化水平隨生理年齡的增加呈上升趨勢(shì)。
　　選擇5年、31年及﹥60年生的毛竹林分，采用35對(duì)引物組進(jìn)行MSAP分析發(fā)現(xiàn)：在毛竹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過程中，隨生理年齡的增加，基因組同時(shí)發(fā)生DNA的甲基化和去甲基化現(xiàn)象，其中發(fā)生甲基化的變異位點(diǎn)（52.3％）遠(yuǎn)大于去甲基化變異位點(diǎn)（10.3%），從而使基因組DNA甲基化率隨年齡的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，方差分析顯示：同一林分的毛竹單株（包括同一出筍年齡和不同出筍年齡的毛竹單株）基因組DN

3、A甲基化水平?jīng)]有顯著差異，但不同生理年齡的毛竹林分間差異達(dá)到了極顯著水平(P＜0.001)。
　　2、篩選6對(duì)引物組合，建立了MSAP技術(shù)下的毛竹基因組DNA甲基化與生理年齡的回歸模型。
　　對(duì)實(shí)驗(yàn)采用的35對(duì)引物組合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選了隨毛竹生理年齡增加DNA甲基化水平增加，而且每相鄰兩個(gè)年齡間差異達(dá)到極顯著水平的6對(duì)引物組合（E+CA/HM+CAC、E+CA/HM+CTC、E+CA/HM+CTG、E+AG/HM+CTA、

4、E+AG/HM+CTC、E+AA/HM+CTA）。將篩選的6對(duì)引物進(jìn)行主成分分析，通過累積貢獻(xiàn)率大于90%以及特征根大于1這兩個(gè)條件，確定各對(duì)引物在判識(shí)毛竹生理年齡中的權(quán)重，得到一個(gè)綜合指標(biāo)，即：Y=0.173x1+0.172x2+0.172x3+0.178x4+0.176x5+0.180x6，用以代表毛竹隨生理年齡變化的基因組DNA總甲基化水平。
　　隨后選擇2年、6年、13年、18年、32年和﹥60年生等6個(gè)年齡段毛竹林分，采

5、用上述的6對(duì)引物進(jìn)行MSAP檢測(cè)。對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，得到毛竹生理年齡與其基因組DNA甲基化率的二次回歸模型：Z=0.542y2+0.003y+17.999，R2=0.970。這對(duì)野外毛竹林分的生理年齡判定具有重要的實(shí)踐意義。
　　3、孝順竹由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)生殖生長(zhǎng)時(shí)基因組DNA甲基化水平明顯降低
　　采用HPLC技術(shù)對(duì)孝順竹開花前后的基因組DNA甲基化進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：孝順竹在未開花的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，DNA甲基化率呈現(xiàn)

6、不規(guī)則的波動(dòng)現(xiàn)象。方差分析顯示：無(wú)論是同一竹叢不同時(shí)期，還是相同時(shí)期不同竹叢DNA甲基化率均無(wú)顯著差異（P=0.109﹥0.05和P=0.622﹥0.05）。
　　對(duì)孝順竹同一叢內(nèi)（同一無(wú)性系）開花與未開花單株的MSAP檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：開花竹株的DNA甲基化變異條帶占了總條帶數(shù)的33.17%，其中發(fā)生甲基化的位點(diǎn)（22.28%）遠(yuǎn)大于去甲基化位點(diǎn)（1.98%），導(dǎo)致開花植株 DNA的甲基化率顯著低于未開花植株，差異達(dá)到了極顯著水平

7、（P＜0.001)。對(duì)開花與未開花竹株的同一樣品分別采用HPLC和MSAP技術(shù)檢測(cè)DNA甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HPLC檢測(cè)的總甲基化率（開花26.69%；未開花30.61%）顯著高于MSAP檢測(cè)結(jié)果（開花9.00%；未開花12.42%），但趨勢(shì)一致。這主要與HPLC技術(shù)能夠測(cè)定基因組整體DNA甲基化水平，而MSAP技術(shù)只能對(duì)全基因組的胞嘧啶甲基化水平進(jìn)行分析的特點(diǎn)有關(guān)。
　　4、同一生理起源、不同生境下的黃稈烏哺雞竹有隨地理緯度的降低

8、，DNA甲基化水平逐漸降低的現(xiàn)象。
　　黃稈烏哺雞是烏哺雞竹的變種，于1982年在浙江省安吉竹博園被發(fā)現(xiàn)，因觀賞價(jià)值高，現(xiàn)已擴(kuò)繁引種到全國(guó)的許多地區(qū)。對(duì)采自北京良鄉(xiāng)、江蘇南京、浙江安吉、江西南昌、四川長(zhǎng)寧、廣東南雄，共6個(gè)地區(qū)的黃稈烏哺雞竹基因組DNA進(jìn)行了研究。首先，采用AFLP技術(shù)對(duì)6個(gè)地區(qū)的樣品進(jìn)行的遺傳多樣性分析表明：同一無(wú)性起源、不同生境下的黃稈烏哺雞竹葉片基因組DNA序列無(wú)明顯差異；但經(jīng)MSAP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：不同地區(qū) DN

9、A總甲基化率和全甲基化率分別為：北京良鄉(xiāng)（33.62%和19.57%）、江蘇南京（33.19%和19.27%）、浙江安吉（31.19%1和8.60%）、江西南昌（30.93%和18.01%）、四川長(zhǎng)寧（29.50%和16.32%）、廣東南雄（28.78%和14.49%），有隨地理緯度的降低DNA甲基化水平呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。
　　另外，將篩選的與毛竹生理年齡相關(guān)的6對(duì)引物組合應(yīng)用于黃稈烏哺雞竹的MSAP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：不同地區(qū)黃稈烏哺雞竹M