小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元損傷的機制及干預(yù)研究.pdf

1、課題目的1.建立小膠質(zhì)細胞激活介導(dǎo)神經(jīng)元損傷實驗體系和藥物篩選體系.2.檢驗該體系的可行性和可信性.3.在體研究EGCG對小膠質(zhì)細胞激活的抑制作用.4.體外深入研究EGCG對小膠質(zhì)細胞激活的抑制作用及其機制.采用方法1.在原代中腦腹側(cè)多巴胺能神經(jīng)元培養(yǎng)培養(yǎng)體系上,利用1-甲基-4-苯基吡啶(Mpp+)造成選擇性多巴胺能神經(jīng)元損傷細胞模型,給予不同劑量EGCG,免疫細胞化學(xué)染色方法標記酪氨酸羥化酶(TH)觀察不同劑量EGCG對陽性細胞數(shù)目

2、的影響.2.通過體視學(xué)方法觀察不同劑量EGCG對1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四羥吡啶(MPTP)所致C57BL/6小鼠選擇性多巴胺能神經(jīng)元損傷這一經(jīng)典動物模型中腦TH陽性細胞數(shù)目的影響,同時利用小膠質(zhì)細胞膜抗原CD11b標記小膠質(zhì)細胞,觀察EGCG對小膠質(zhì)細胞激活的作用.3.通過兩種不同的方法--選擇性貼附振搖分離法和溫和消化法獲取純化的小膠質(zhì)細胞,利用Dil-ac-LDL標記技術(shù)、Greiss反應(yīng)和ELISA方法,比較這兩種方法

3、的得率、所獲小膠質(zhì)細胞的純度、形態(tài)和生物學(xué)特性如釋放NO和TNF-α這兩種重要的與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細胞因子的能力.4.全反式維甲酸誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤株SH-SY5Y細胞分化為具有多巴胺能神經(jīng)元特性的細胞.利用該細胞模型,采用MTT方法和3H標記多巴胺攝取作用,觀察細菌脂多糖(LPS)激活小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y的損傷作用.5.在高度純化的小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)體系中,利用Dil-ac-LDL原位標記技術(shù),觀察EGCG對小膠質(zhì)細胞激活所

4、致的形態(tài)學(xué)改變、NO和TNF-α釋放的抑制作用.6.更進一步,用免疫印記方法(Western blotting)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究EGCG對NO和TNF-α釋放的抑制作用是否通過下調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-αmRNA而實現(xiàn).7.結(jié)合溫和消化法分離小膠質(zhì)細胞技術(shù)和SH-SY5Y誘導(dǎo)分化細胞模型,通過系列濃度LPS的刺激和所產(chǎn)條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y的損傷作用,檢驗該系統(tǒng)的可行性.8.最后,利用原代中