Notch信號(hào)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化對(duì)帕金森病模型多巴胺能神經(jīng)元的影響.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是多發(fā)于中老年人的第二大神經(jīng)退行性疾病,65歲以上人群患病率大約1-2％,且隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展,其發(fā)病率仍在逐漸升高。目前有關(guān)PD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,但各種毒性作用所引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是神經(jīng)退行性變的重要機(jī)制之一,而作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)原位免疫細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞則是炎癥過(guò)程的主要參與者,適當(dāng)?shù)馗深A(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)則有可能延緩PD的病理進(jìn)展。依據(jù)周?chē)h(huán)境的不同,小膠質(zhì)細(xì)胞

2、表現(xiàn)為兩種不同的極化表型:經(jīng)典活化M1型能促進(jìn)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生神經(jīng)毒性;選擇活化M2型則有抗炎及損傷修復(fù)作用。
　　Notch信號(hào)途徑通過(guò)局部細(xì)胞間的相互作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊、胞漿內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄,從而控制細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移及粘附等。Notch信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞發(fā)育和功能調(diào)控中具有重要意義,同樣也應(yīng)參與調(diào)控不同環(huán)境刺激條件下小膠質(zhì)細(xì)胞的活化反應(yīng)。
　　目前,已有研究證實(shí)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞及MMGT12、BV2等

3、小膠質(zhì)細(xì)胞系在不同刺激下表現(xiàn)為不同的極化反應(yīng)。課題組前期用N9小膠質(zhì)細(xì)胞系對(duì)這一反應(yīng)及Notch信號(hào)對(duì)該極化反應(yīng)的調(diào)控作用進(jìn)行了初步探索,但在PD動(dòng)物模型或患者大腦中,小膠質(zhì)細(xì)胞活化后發(fā)生哪種極化反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮何種作用,以及Notch信號(hào)的調(diào)控是否對(duì)其有影響,目前尚無(wú)明確報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在制作小鼠PD模型的基礎(chǔ)上,觀察PD小鼠中腦黒質(zhì)部小膠質(zhì)細(xì)胞的表型,并通過(guò)體內(nèi)、外阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的Notch信號(hào),觀察其極化表型變化及其對(duì)周?chē)窠?jīng)元的影響。<

4、br>　　目的:
　　(1)制作野生C57/B6小鼠PD模型并觀察其中腦黒質(zhì)部多巴胺神經(jīng)元的凋亡及小膠質(zhì)細(xì)胞的極化表現(xiàn);
　　(2)驗(yàn)證體外原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞在不同刺激環(huán)境下的極化反應(yīng),觀察Notch信號(hào)阻斷后,不同刺激后的極化反應(yīng)改變情況;
　　(3)制作Notch信號(hào)敲除小鼠的PD模型,觀察體內(nèi)阻斷Notch信號(hào)后,黒質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元數(shù)量的變化情況。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)、體外阻斷Notch信號(hào),觀察Not

5、ch信號(hào)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化反應(yīng)的影響,以期為通過(guò)干擾Notch信號(hào)的活性而減少PD等神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元的丟失,減緩疾病進(jìn)展提供初步理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahy-dropyridine,MPTP)誘導(dǎo)制作PD模型,觀察其一般行為學(xué)表現(xiàn),曠場(chǎng)試驗(yàn)與強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠行為學(xué)改變;制作小鼠腦組織冰凍切片,免

6、疫熒光染色觀察多巴胺神經(jīng)元數(shù)量改變及小膠質(zhì)細(xì)胞極化表現(xiàn);
　　(2)在原代培養(yǎng)混合膠質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)上,使用震蕩分離法得到單純小膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL6的含量;用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞M1和M2型標(biāo)志分子的表達(dá)水平;
　　(3)剪取小鼠尾巴提取全基因組,通過(guò)PCR擴(kuò)增后,使用瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定Notch信號(hào)敲除小鼠基因型;選取Notch信號(hào)敲除小鼠和對(duì)照小鼠制

7、作PD模型,通過(guò)腦組織冰凍切片的免疫熒光染色觀察腦組織多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量變化。
　　結(jié)果:
　　(1)模型組小鼠每次注射MPTP后可出現(xiàn)活動(dòng)減弱,呼吸急促,弓背、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾及震顫、癲癇發(fā)作等不同程度的行為表現(xiàn),對(duì)照組除個(gè)別小鼠有短暫的激惹反應(yīng)外,無(wú)其他明顯表現(xiàn);模型組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)總路程較對(duì)照組小鼠有減少趨勢(shì),但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而其中央活動(dòng)時(shí)間較正常對(duì)照組明顯縮短(P<0.05);強(qiáng)迫游泳實(shí)

8、驗(yàn)中,模型組小鼠在水中的不動(dòng)時(shí)間較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組小鼠黒質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少約87%(P<0.01),M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加約54%(P<0.05),M2型細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化;
　　(2)震蕩分離法獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)96.33%;LPS刺激后,培養(yǎng)液上清中IL-6、TNF-а含量增加(P<0.05),iNOS、CD

9、86表達(dá)上調(diào);IL-4刺激后IL-6、TNF-а、iNOS、CD86與空白對(duì)照組均無(wú)明顯區(qū)別,但MMR、YM1及Arg1表達(dá)升高(P<0.05);γ-分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor,GSI)預(yù)處理組后,LPS處理組培養(yǎng)液上清中IL-6含量減少(P<0.05),TNF-а無(wú)明顯區(qū)別,iNOS、CD86表達(dá)下調(diào)(P<0.05);IL-4處理組MMR、YM1及Arg1表達(dá)呈升高趨勢(shì);
　　(3)Notc

10、h信號(hào)敲除仔鼠大腦皮層、海馬、中腦和小腦等區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量無(wú)明顯變化;成年Lyz2CreRBP-Jflox-/-的基因敲除小鼠及Lyz2CreRBP-Jflox+/-小鼠制作PD模型后,基因敲除組小鼠腦黒質(zhì)部存活的神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組的多(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)PD模型小鼠的行為學(xué)及組織病理學(xué)改變顯示造模成功;在PD小鼠腦內(nèi),小膠質(zhì)細(xì)胞M1、M2兩型極化同時(shí)存在,M1型極化的作用大于M2型;