TET1介導的DNA羥甲基化對胃癌相關基因PTEN和EpCAM表達調控的研究.pdf

1、目的：表觀遺傳學對腫瘤相關基因表達的調控已成為腫瘤研究領域中一個重要的研究方向。而DNA甲基化與去甲基化狀態(tài)的改變是表觀調控最經典的研究方向。DNA的羥甲基化是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的，可以使 DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生改變的調控方式。DNA羥甲基化主要是由TET家族的TET1，TET2和TET3介導的。實體組織中的羥甲基化主要由 TET1來完成。目前已有相關文獻報道，TET蛋白在諸多腫瘤中表達量明顯下降，以及隨之出現(xiàn)的基因組5-hmC含量的下調。這

2、些現(xiàn)象提示，TET參與的5-hmC對DNA的表觀調控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在本課題中，我們主要研究 TET1對胃癌生物學行為的影響，同時進一步研究 TET1對胃癌相關基因的調控機制。
　　方法：本研究中，我們使用免疫組化(IHC)，Western blot，Dot blot檢測胃癌組織及細胞內TET1蛋白和5-hmC的含量。使用卡方檢驗分析了TET1的表達與胃癌臨床病理數(shù)據(jù)之間的關系。使用TET1 shRNA和TE

3、T1過表達質粒在胃癌細胞系中敲低和過表達TET1，后續(xù)使用CCK-8，劃痕實驗和transwell實驗來觀察TET1對胃癌細胞生物學行為的影響。使用實時定量PCR（qPCR）檢測了TET1相關靶基因的表達量，并對這些潛在的靶基因的啟動子區(qū)域使用亞硫酸氫鹽測序 PCR（BSP）來檢測甲基化的程度。后續(xù)我們使用GluMS-PCR檢測了相關基因啟動子區(qū)域的5-hmC的含量。在本研究中，我們還使用了Western blot檢測了TET1敲低和過

4、表達后AKT和FAK通路的活化狀態(tài)，以明確TET1對胃癌細胞的影響是通過何種途徑發(fā)揮作用的。在實驗的最后，我們使用裸鼠皮下成瘤和腹膜轉移模型來說明 TET1敲低后在體內實驗中增加了胃癌細胞的增殖和轉移。
　　結果：（1）我們發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組組織，TET1的表達在胃癌組織中明顯降低（Wilcoxon檢驗 p=0.036），同時基因組的羥甲基化的水平在腫瘤組織中也明顯下降；（2）Kaplan-meier分析顯示TET1高表達的胃癌患者

5、的生存要優(yōu)于TET1低表達的患者（p<0.01）。（3）在胃癌細胞系NCI-N87中敲低TET1可以通過CCK-8實驗明顯地觀察到胃癌細胞的增殖（p<0.05），同時遷移和侵襲能力也增強（p<0.01）。而在 SGC7901中過表達 TET1可以明顯抑制胃癌細胞增殖（p<0.05）和轉移能力（p<0.01）；（4）TET1可以引起經典的胃癌相關基因如PTEN啟動子區(qū)域羥甲基化和甲基化的改變，TET1在NCI-N87中敲低后，PTEN啟動

6、子區(qū)域甲基化從1.5%升高到12%，而TET1在SGC7901中過表達之后，PTEN啟動子區(qū)域甲基化從3%下降到0.9%。通過ChIP我們證明了TET1可以結合至PTEN的啟動子區(qū)域對其進行調控。（5）在動物實驗中，相對于對照組，TET1敲低的胃癌細胞形成的腫瘤體積更大，重量更重（p<0.05）。同時相對于對照組，TET1敲低的胃癌細胞在裸鼠腹腔內形成了更多的轉移結節(jié)（p<0.01）。
　　結論：通過本研究，我們發(fā)現(xiàn) TET1在胃