腦膠質(zhì)瘤中基因的甲基化水平與miR-101介導(dǎo)的組蛋白甲基化修飾機(jī)制.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，生存率低，研究表明，miRNA表達(dá)異常、DNA甲基化狀態(tài)改變、組蛋白修飾等表觀遺傳機(jī)制的異常在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期采用最新高通量甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）結(jié)合啟動子區(qū)及CpG島芯片技術(shù)，篩選并初步建立腦膠質(zhì)瘤基因組DNA甲基化譜。通過Massarray、亞硫酸氫鹽修飾直接測序法(BSP)等進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了LRRC4等9個(gè)腦膠質(zhì)瘤中新的高甲基化基因。通過H

2、PLC-DAD技術(shù)對全基因組甲基化分析發(fā)現(xiàn)，抑瘤性miR-185可通過直接靶向DNMT1的表達(dá)而影響全基因組的甲基化水平，進(jìn)而調(diào)控上述高甲基化基因在腦膠質(zhì)瘤中的甲基化修飾狀態(tài)，恢復(fù)這些基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。
　　【確定F10、POTEH、CPEB1、LM03、ELFN2及PRDM16為腦膠質(zhì)瘤中新的低甲基化基因，其甲基化狀態(tài)和表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)】
　　在上述研究工作基礎(chǔ)上，本課題利用Signalmap軟件對甲

3、基化芯片篩選出的74個(gè)低甲基化基因進(jìn)行再次篩選，挑選出F10、POTEH、CPEB1、LM03、ELFN2、PRDM16、CD207、BAD、NRBP2、SLITRK5、SLC44A2及PGP等12個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。通過BSP方法在大樣本腦膠質(zhì)瘤組織中檢測，發(fā)現(xiàn)CD207、BAD、NRBP2、SLITRK5、SLC44A2及PGP基因在腦膠質(zhì)瘤組織（n=6例）中的甲基化程度與正常腦組織（n=4例）無差異;證實(shí)F10（n=102例）、POT

4、EH（n=102例）、CPEB1（n=56例）、LMO3（n=56例）、ELFN2（n=56例）及PRDM16( n=56例）基因在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中發(fā)生低甲基化，是腦膠質(zhì)瘤中新發(fā)現(xiàn)的低甲基化基因，這些基因的低甲基化與其在腦膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)密切相關(guān)。通過對腦膠質(zhì)瘤患者的跟蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，這些新發(fā)現(xiàn)的低甲基化基因的低甲基化及其在腦膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)均可以作為腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后預(yù)測的重要標(biāo)志，低甲基化基因在腦膠質(zhì)瘤中的甲基化程度越低、表達(dá)越高，患

5、者的預(yù)后越差。同時(shí)。F10基因低甲基化與患者年齡相關(guān);POTEH蛋白高表達(dá)及PRDM16基因低甲基化與患者病理分級相關(guān)。因此，POTEH基因的高表達(dá)和PRDM16基因的低甲基化是腦膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的重要分子診斷標(biāo)志物，POTEH基因在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)越高或PRDM16基因在腦膠質(zhì)瘤中的甲基化程度越低，其腦膠質(zhì)瘤的惡性程度就越高。
　　【miR-101在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，是腦膠質(zhì)瘤患者早期發(fā)病的重要分子標(biāo)志物，并與腦膠質(zhì)瘤患者的

6、預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)越低，患者預(yù)后越差】
　　有文獻(xiàn)證實(shí)，miR-101在多種腫瘤中表達(dá)降低并發(fā)揮抑瘤基因的作用。因此，我們用原位雜交的方法進(jìn)一步檢測了腦膠質(zhì)瘤組織( n=50例)和正常腦組織（n=10例）中的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)，miR-101在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)低于正常腦組織，腦膠質(zhì)瘤I級患者中顯著高于其它級別的腦膠質(zhì)瘤患者，但在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)無差異，所以我們認(rèn)為miR-101的表達(dá)下調(diào)與腦膠質(zhì)瘤患者的早期發(fā)病密

7、切相關(guān)，與腦膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展無關(guān)。miR-101在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)。通過對腦膠質(zhì)瘤患者的跟蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-101在腦膠質(zhì)瘤中的低表達(dá)可以作為腦膠質(zhì)瘤患者早期發(fā)病和預(yù)后預(yù)測的重要標(biāo)志，miR-101在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)越低，患者的預(yù)后越差。
　　【低甲基化基因CPEB1、PRDM16和ELFN2是miR-101的直接作用靶基因，miR-10I靶向抑制它們在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)】
　　許多研究已經(jīng)證實(shí)m

8、iRNA在腫瘤中通過調(diào)控基因的表達(dá)發(fā)揮著非常重要的作用。我們設(shè)想從miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)的角度來分析低甲基化基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。于是預(yù)測了能調(diào)控F10、POTEH、CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16的miRNA，試圖從中找出共同點(diǎn)或某種規(guī)律。令我們興奮的是，在線軟件Targetscan6.0預(yù)測發(fā)現(xiàn)CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16可以共同受一個(gè)miRNA-miR-101的調(diào)控。熒光素酶活性檢測、real-ti

9、me PCR和Westem-blot檢測表明，miR-101能與CPEB1、PRDM16和ELFN23'UTR結(jié)合，并且靶向抑制它們在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá);miR-101雖不與LM033'-UTR結(jié)合，但是仍然可以抑制LM03在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。
　　【miR-101靶向抑制EZH2、EED和DNMT3A的表達(dá)，下調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶活性，抑制LMO3核心啟動子區(qū)H3K4me2、H3K27me3水平，增加H3K9me3和H4K20me

10、3水平，增加LMO3啟動子區(qū)甲基化水平，間接抑制LM03在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)】
　　我們進(jìn)一步研究miR-101調(diào)控低甲基化基因LMO3表達(dá)的機(jī)制。有文獻(xiàn)證實(shí)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2是miR-101的直接靶基因，我們通過在線軟件Targetscan6.0、miRanda及PicTar預(yù)測發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EED及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A是miR-101的靶基因，并且證實(shí)miR-101在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中直接抑制EZH2、EE

11、D及DNMT3A的表達(dá)，miR-101還能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中H3K4去甲基化酶、H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶、DNMT3A甲基轉(zhuǎn)移酶活性，增加H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶和DNMT甲基轉(zhuǎn)移酶活性。鑒于EZH2、EED及DNMT3A具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，我們認(rèn)為，miR-101極可能通過EZH2、EED及DNMT3A影響組蛋白甲基化修飾。于是，我們檢測了miR-101及干擾EZH2、EED及DNMT3A的表達(dá)對LM03核心啟動子區(qū)組蛋白甲基化修飾的影響，發(fā)現(xiàn)m

12、iR-IOI通過靶向抑制EZH2、EED及DNMT3A的表達(dá)抑制LM03核心啟動子區(qū)H3K27me3和H3K4me2水平，增加H3K9me3和H4K20me3水平，增加LMO3啟動子區(qū)甲基化水平，間接抑制LMO3在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。
　　【miR-101通過靶向EZH2、EED和DNMT3A調(diào)控低甲基化基因CPEB1、ELFN2和PRDM16核心啟動子區(qū)的組蛋白甲基化修飾，影響其甲基化水平，間接抑制它們在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)】

13、
　　既然miR-101能通過組蛋白修飾調(diào)控LMO3的甲基化狀態(tài)及表達(dá)，也可能以同樣的機(jī)制調(diào)控低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16的甲基化狀態(tài)。因此，我們檢測了miR-101和干擾EZH2、EED及DNMT3A的表達(dá)對低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16表達(dá)以及對其核心啟動子區(qū)組蛋白甲基化修飾的影響，并檢測了miR-101對低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16甲基化狀態(tài)的影響。通過ChIP結(jié)合q

14、RT-PCR、BSP等實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-101通過靶向EZH2、EED和DNMT3A，降低CPEBI、PRDM16及ELFN2核心啟動子區(qū)H3K4me2、H3K27me3的水平，增加CPEB1、PRDM16核心啟動子區(qū)H3K9me3、H4K20me3水平，恢復(fù)CPEB1、ELFN2及PRDM16基因啟動子區(qū)甲基化水平，間接抑制低甲基化基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。
　　【miR-101通過下調(diào)高甲基化基因LRRC4核心啟動子區(qū)H3K2

15、7me3水平，使LRRC4啟動子區(qū)去甲基化，恢復(fù)LRRC4在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)】
　　LRRC4是我室自主克隆的腦膠質(zhì)瘤抑瘤基因，并被證實(shí)在腦膠質(zhì)瘤中高甲基化。為了研究LRRC4在腦膠質(zhì)瘤中的調(diào)控機(jī)制，我們首先預(yù)測了調(diào)控LRRC4的miRNA，發(fā)現(xiàn)LRRC4是miR-101的預(yù)測靶基因，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-101并不與LRRC43'UTR結(jié)合，但是miR-101能上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LRRC4的表達(dá)并低甲基化LRRC4，抑制EZH2、E

16、ED及DNMT3A的表達(dá)能抑制LRRC4核心啟動子區(qū)H3K27me3水平促進(jìn)表達(dá)上調(diào)，說明miR-101通過抑制EZH2、EED及DNMT3A的表達(dá)，抑制LRRC4核心啟動子區(qū)H3K27me3水平，使LRRC4啟動子區(qū)去甲基化，從而恢復(fù)LRRC4在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。
　　總之，基因的高、低甲基化異常修飾在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，通過檢測基因在腦膠質(zhì)瘤中的高、低甲基化及其表達(dá)，可以用于腦膠質(zhì)瘤的早期診斷和預(yù)后預(yù)測。m