EZH2介導(dǎo)BPD新生大鼠RUNX3基因組蛋白甲基化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysphasia，BPD)是一種常見(jiàn)的新生兒期疾病，患兒多為出生體重小于1500克，胎齡小于30周的早產(chǎn)兒，由于宮內(nèi)受到炎癥感染或者生后受到機(jī)械通氣、高氧等環(huán)境因素的刺激，在給予肺表面活性物質(zhì)后，仍需長(zhǎng)期依賴氧氣，并伴有不同程度的呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。
　　本文分別檢測(cè)了BPD模型中，肺組織和AECⅡ里DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的

2、表達(dá)，以及runx3基因是否發(fā)生DNA甲基化和組蛋白H3K27me3修飾，并在此基礎(chǔ)上分析不同程度抑制DNMTs、H3K27me3、EZH2后AECⅡ中runx3基因的表達(dá)。試圖說(shuō)明BPD新生大鼠模型中DNA甲基化和組蛋白H3K27me3修飾對(duì)runx3基因的調(diào)節(jié)作用，從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)一步討論BPD的病理機(jī)制，為BPD的早期篩選和后期治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　一、動(dòng)物模型的制備和標(biāo)本的采集
　　將192只新

3、生SPrague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為模型組（吸入氧濃度為85％）和對(duì)照組（吸入氧濃度為21％）。為了避免氧毒性對(duì)母鼠的影響，每24小時(shí)替換一次模型組和對(duì)照組的母鼠，并補(bǔ)充水和食物。分別于造模后1d、7d、10d和14d，從模型組和對(duì)照組中各提取8只新生大鼠，通過(guò)腹腔注射5％水合氯醛麻醉，隨后按照無(wú)菌操作開(kāi)胸腔取全肺組織用于實(shí)驗(yàn)。
　　二、細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　1、BPD新生大鼠模型肺組織中分離AECⅡ:分別于造模后

4、1d、7d、10d和14d，從模型組和對(duì)照組中提取新生大鼠，通過(guò)腹腔注射5％水合氯醛麻醉，隨后按照無(wú)菌操作開(kāi)胸腔取全肺組織。在機(jī)械分離和酶消化后，依次經(jīng)過(guò)差速離心、差速貼壁等方法純化后，次日得到較純的AECⅡ，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力在95％以上，AECⅡ板層小體標(biāo)記物P180免疫熒光染色顯示細(xì)胞純度約為90％。
　　2、新生大鼠肺組織中分離AECⅡ:生后24h以內(nèi)的新生大鼠，麻醉后分離肺組織，按照上述方法提取AECⅡ。
　　

5、三、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　將新生大鼠肺組織中分離AECⅡ接種在6孔板后，在不同氧濃度的環(huán)境中培養(yǎng)，分別為模型組（吸入氧濃度為85％）和對(duì)照組（吸入氧濃度為21％）。每組細(xì)胞分別給予不同濃度的5-aza-CdR(2.5μ mol/L、5μmol/L、10μmol/L)或Jmjd3(10μg/L、20μg/L、40μg/L)或DZNep(1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L)，持續(xù)48h?；蛘叻謩e用5μmol/L的5-aza-C

6、dR或20μg/L的Jmjd3或1μmol/L的DZNep進(jìn)行干預(yù)，持續(xù)時(shí)間依次為24h、48h、72h.在收集細(xì)胞之前，每24h更換一次藥物和培養(yǎng)基。陰性對(duì)照組細(xì)胞和陰性模型組細(xì)胞為未加任何藥物的模型組和對(duì)照組細(xì)胞。收集細(xì)胞后，用液氮轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存，用于隨后的實(shí)驗(yàn)。
　　四、實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)
　　1、肺組織HE染色:光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變，測(cè)定輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(the number of radial al

7、veolar count、RAC)、肺泡面積朋市間隔面積(the alveolararea/pulmonary septal area ratio、A/S)。
　　2、免疫組織化學(xué)染色:觀察肺組織中DNMT1、DNMT3b、H3K27me3、EZH2和RUNX3蛋白的表達(dá)。
　　3、Western blot:檢測(cè)肺組織和細(xì)胞樣本中DNMT1、DNMT3b、H3K27me3、EZH2和RUNX3蛋白的表達(dá)，以及不同藥物干預(yù)AE

8、CⅡ后RUNX3蛋白的表達(dá)。
　　4、Real-time PCR:檢測(cè)肺組織和細(xì)胞樣本中DNMT1、DNMT3b、H3K27me3、EZH2和RUNX3的mRNA的表達(dá)，以及不同藥物干預(yù)AECⅡ后基因的表達(dá)。
　　5、Bisulfite sequencing PCR:檢測(cè)模型組和對(duì)照組AECⅡ中runx3基因發(fā)生DNA甲基化的比例。
　　6、Chromatin Immunoprecipitation Assay:分別檢

9、測(cè)模型組和對(duì)照組AECⅡ中H3K27me3、EZH2與runx3基因結(jié)合水平。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較分析采用t檢驗(yàn)，多組內(nèi)比較分析采用單因素方差分析(ANOVA)，相關(guān)性分析使用Pearson's test，所有數(shù)據(jù)使用mean(x)±standard deviation(SD)表示。P＜0.05顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　一、肺組織形態(tài)學(xué)改變
　　

10、1、組織病理學(xué)改變
　　肺組織病理顯示模型1d組與對(duì)照1d組的組織形態(tài)學(xué)無(wú)差異，模型7d組肺泡腔中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡腔逐漸增大，14d后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺泡腔較前增大，肺泡數(shù)減少，肺間隔變薄。
　　2、肺發(fā)育評(píng)價(jià)
　　與對(duì)照組相比，模型組RAC值1d無(wú)差異(P＞0.05），7d開(kāi)始降低并持續(xù)至14d(P＜0.05)。模型組和對(duì)照組A/S值1d無(wú)明顯差異(P＞0.05)，模型組A/S值7d開(kāi)始升高(P＜0.0

11、5)，14d達(dá)最高(P＜0.05)。
　　二、BPD新生大鼠肺組織和AECⅡ中runx3基因的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示RUNX3蛋白在AECⅡ的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中有表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組7d起，肺組織和AECⅡ中RUNX3蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下降(P＜0.05）。
　　三、BPD新生大鼠AECⅡ中runx3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化比例
　　對(duì)照組和模型組AECⅡ中runx3基因均呈高甲基化狀態(tài)，而且模

12、型組比例明顯高于對(duì)照組(P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組7d發(fā)生DNA甲基化的比例無(wú)顯著差異(P＞0.05），而14d呈高甲基化狀態(tài)（P＜0.05）。
　　四、BPD新生大鼠AECⅡ中H3K27me3與runx3基因的結(jié)合
　　與對(duì)照組相比，BPD模型組runx3基因與H3K27me3直接結(jié)合，且呈顯著的高水平(P＜0.05)。
　　五、BPD新生大鼠肺組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)方法檢結(jié)果

13、顯示對(duì)照組DNMT1蛋白在肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，模型組DNMT1蛋白幾乎不表達(dá)。模型組和對(duì)照組DNMT3b蛋白在肺泡上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中均有表達(dá)。通過(guò)Western blot和Real-time PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)下肺組織中兩種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，模型組肺組織中DNMT1蛋白7d開(kāi)始升高，10d達(dá)高峰后開(kāi)始下降(P＜0.05），DNMT3b蛋白從7d起，呈持續(xù)高表達(dá)(P＜0.05）。D

14、NMT1和DNMT3b的mRNA改變無(wú)顯著性差異(P＞0.05）。
　　六、BPD新生大鼠肺組織提取AECⅡ中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)
　　與對(duì)照組相比，模型組AECⅡ中DNMT1蛋白7d開(kāi)始迅速下降，呈持續(xù)低表達(dá)(P＜0.05），DNMT3b蛋白從10d開(kāi)始升高，呈顯著高表達(dá)(P＜0.05）。DNMT1和DNMT3b的mRNA改變無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　七、BPD新生大鼠肺組織和AECⅡ中組蛋白H3K27m

15、e3的表達(dá)
　　對(duì)照組和模型組H3K27me3蛋白多分布在肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)。與對(duì)照組相比，肺組織中H3K27me3蛋白從1d起顯著性增高(P＜0.05)，AECⅡ中H3K27me3蛋白分別從1d起顯著性增高(P＜0.05)。
　　八、BPD新生大鼠AECⅡ中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、H3K27me3與RUNX3蛋白表達(dá)相關(guān)性分析
　　AECⅡ中RUNX3蛋白水平與DNMT1、DNMT3b的表達(dá)進(jìn)行了

16、相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNMT1蛋白與RUNX3蛋白呈正相關(guān)（r=0.415，P=0.018），DNMT3B與RUNX3蛋白呈明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.527，P=0.002)，H3K27me3與RUNX3蛋白呈明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.756，P=0.000)。
　　九、BPD新生大鼠肺組織和AECⅡ中組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)
　　模型組EZH2蛋白在肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，對(duì)照組幾乎不表達(dá)。與對(duì)照組相比，肺組織

17、中EZH2蛋白從10d起顯著性增高(P＜0.05），AECⅡ中EZH2蛋白從7d起顯著性增高（P＜0.05）。Real-time PCR結(jié)果顯示肺組織中EZH2的mRNA水平從1d開(kāi)始呈持續(xù)高表達(dá)(P＜0.05），AECⅡ中從7d開(kāi)始增高，但不顯著(P＞0.05）。
　　十、BPD新生大鼠AECⅡ中EZH2蛋白與RUNX3蛋白表達(dá)相關(guān)性分析
　　AECⅡ中EZH2與RUNX3蛋白呈明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.879，P=0.00