組蛋白的甲基化修飾在人Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)中作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)在自身免疫耐受和免疫自穩(wěn)中起著非常關(guān)鍵的作用，其在胸腺內(nèi)發(fā)育成為一類獨立的CD4+T細(xì)胞亞群。許多研究結(jié)果都觀察到表觀遺傳調(diào)控對于控制Treg細(xì)胞基因特別是Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子3(the forkhead/winged-helix protein3，F(xiàn)OXP3)的表達(dá)起到很關(guān)鍵的作用。Treg細(xì)胞和普通的T細(xì)胞相比，F(xiàn)OXP3基因不同區(qū)域的DNA甲基

2、化和特異性的組蛋白修飾方式是不同的。但是目前的研究主要還是集中在DNA的甲基化是如何調(diào)控Treg基因的表達(dá)，關(guān)于組蛋白修飾，特別是與啟動子相關(guān)的H3K4me3修飾(trimethylated histone H3 lysine4)和與增強(qiáng)子相關(guān)的H3K4me1修飾(monomethylated histone H3 lysine4)，對于Treg細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用研究很少。
　　因此，本研究擬采用ChIP-Seq的技術(shù)，繪制并

3、比較Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me3和H3K4me1修飾的全基因組圖譜，從而對H3K4me3和H3K4me1這兩種修飾在Treg細(xì)胞基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步的探討。
　　實驗方法：
　　一、人CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增和純化：
　　1．人CD4+CD25+Treg細(xì)胞的分離和純度檢測：用磁珠分選(magnetic-activated cell-sorting，MACS)的方法

4、從人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中分離CD4+CD25+T細(xì)胞；用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)的方法檢測分選后細(xì)胞的純度；
　　2．人CD4+CD25+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增與純度檢測：用Invitrogen公司人Treg細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增；用FCM的方法檢測擴(kuò)增過程中FOXP3+細(xì)胞的純度；
　　3．?dāng)U增

5、后細(xì)胞的抑制功能檢測：擴(kuò)增后細(xì)胞與CFSE(5-and-6 carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester)標(biāo)記的CD4+CD25-T細(xì)胞不同比例混合(0:1,1:1,1:2,1:4)，F(xiàn)CM檢測CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖情況；
　　4．?dāng)U增后細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選：用CD4、CD25和FOXP3三個標(biāo)記對擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選(fluorescence activated

6、 cell sorting，F(xiàn)ACS)，分選出CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞和CD4+CD25+FOXP3-T(aTconv)細(xì)胞。
　　二、H3K4me3和H3K4me1在人Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中的作用：
　　1．染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(chromatin immunoprecipitation，ChIP)及高通量測序前后已知位點的實時定量PCR(quantitative real-time PCR，QPCR

7、)檢測：用抗H3K4me3抗體和抗H3K4me1抗體及其陰性對照抗體IgG對擴(kuò)增后的Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞進(jìn)行ChIP;用ChIP-QPCR的方法對選取的陽性位點進(jìn)行檢測，我們選取了部分與Treg細(xì)胞功能相關(guān)基因的啟動子或者H3K4me1位點作為陽性位點，例如FOXP3，白介素2受體α(interleukin2 receptor alpha，IL2RA)，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid induce

8、d tumor necrosis factor receptor，GITR)，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4),趨化因子受體7(chemokine(C-Cmotif) receptor7，CCR7)以及信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)家族；<

9、br>　　2．ChIP樣本的高通量測序(high-throughput sequencing)及生物信息學(xué)分析：將ChIP DNA樣本送往深圳華大基因研究所，使用Solexa1G Genome Analyzer高通量側(cè)測序儀進(jìn)行高通量測序；用比對軟件SOAP(short oligonucleotide analysis package)將測序數(shù)據(jù)與人類基因組序列進(jìn)行比對，獲得唯一比對的reads；用MACS(Model-based An

10、alysis for ChIP-Seq)方法進(jìn)行全基因組peaks的掃描，獲得H3K4me3 peaks和H3K4me1 peaks；
　　3．Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞的H3K4me3和H3K4me1修飾的全基因組圖譜及其比較：人類基因組分為四個部分，即近端啟動子區(qū)(proximal promoters)、外顯子區(qū)(exons)、內(nèi)含子區(qū)(introns)、基因間區(qū)(intergenic sequences)，統(tǒng)計Peaks

11、在這些區(qū)域分布的比例；通過生物信息學(xué)鑒定Treg細(xì)胞或者aTconv細(xì)胞之間共有的或者特異性的H3K4me3 peaks、H3K4me1 peaks、H3K4me3 proximal promoters以及proximal promoters相關(guān)基因；
　　4．Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞特異性或者共有基因的H3K4me3和H3K4me1修飾特征：選取與Treg細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因，例如FOXP3，IL2RA，CTLA4、TN

12、FRSF18、STAT家族和CCR7等，將ChIP-Seq數(shù)據(jù)在UCSC Genome Browser以圖形化的方式展示，比較這些基因H3K4me3和H3K4me1的修飾特征；用QPCR的方法鑒定這些基因在這兩類細(xì)胞之間的mRNA表達(dá)水平差異；
　　5．Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞特異性或者共有的H3K4me1位點的功能鑒定：運用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬碜C實候選的H3K4me1片段是否具有增強(qiáng)子的活性。
　　實驗結(jié)果：

13、r>　　第一部分：人CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增和純化
　　1．MACS的方法從PBMC中分離了CD4+CD25+T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+T細(xì)胞的純度為93.7％；
　　2．用Invitrogen公司商品化的人CD4+CD25+Treg細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒對MACS分選的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增70天后，細(xì)胞絕對數(shù)擴(kuò)大了1000倍以上；但是在細(xì)胞擴(kuò)增的整個過程中，我們通過CD4、CD25和

14、FOXP3這三個標(biāo)志進(jìn)行Treg細(xì)胞純度的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞絕對數(shù)的不斷增加，CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的純度不斷降低；
　　3．CFSE標(biāo)記的CD4+CD25-T細(xì)胞與體外擴(kuò)增的CD4+CD25+T細(xì)胞分別按1:0,1:1,2:1,4:1比例混合，在CD3抗體與CD28抗體聯(lián)合作用下，刺激7天后進(jìn)行流式檢測，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增后的CD4+CD25+T細(xì)胞可以有效的抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖；
　　4．用C

15、D4、CD25和FOXP3這個三個標(biāo)志，對擴(kuò)增后細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選，最終我們得到了2×106個純度為99％的CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞以及1×107個純度為99.4％的CD4+CD25+FOXP3-T細(xì)胞,我們將其分別命名為Treg細(xì)胞和活化的普通T細(xì)胞(active conventional T cells，aTconv)。
　　第二部分：H3K4me3在人Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中作用
　　1．高通量測

16、序前通過對已知位點的QPCR檢測，結(jié)果顯示：已知基因的啟動子區(qū)域，在Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞中都會被H3K4me3高度修飾，而在陰性對照組IgG中,幾乎不發(fā)生H3K4me3的富集；但是FOXP3基因的啟動子區(qū)域例外，結(jié)果顯示僅僅Treg細(xì)胞中會發(fā)生強(qiáng)烈的H3K4me3修飾，在aTconv細(xì)胞和陰性對照組中，沒有富集。這些結(jié)果與理論是一致的，從而保證了樣品的可靠性;
　　2．ChIP樣品送往深圳華大基因研究所進(jìn)行高通量測序，經(jīng)

17、過生物信息學(xué)分析，得到了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me3的全基因組圖譜;
　　3．運用生物信息學(xué)的方法首先從整體上比較了兩樣品的H3K4me3 peaks，發(fā)現(xiàn)：peaks的相關(guān)系數(shù)為0.92且共有的peaks數(shù)目為20784;然后比較了兩類細(xì)胞之間的H3K4me3 proximal promoters，發(fā)現(xiàn)promoters的相關(guān)系數(shù)為0.83且有15508個共有的proximal promoters；最后比較了H3

18、K4me3 proximal promoters相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)絕大部分的基因是共有基因，只有1220個Treg細(xì)胞特異性的基因，這其中就包括Treg細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3；
　　4．選取了與Treg細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因，例如FOXP3，IL2RA，CTLA,腫瘤壞死因子受體超家族成員18(tumor necrosis factor receptor superfamily member18，TNFRSF18)，STAT家

19、族和CCR7，通過UCSC Genome Browser圖形化展示，發(fā)現(xiàn)：IL2RA，CTLA4，TNFRSF18和STATs這些基因的啟動子區(qū)域，不管是在Treg細(xì)胞還是aTconv細(xì)胞，都發(fā)生了比較強(qiáng)烈的H3K4me3修飾。但是FOXP3和CCR7基因啟動子區(qū)域，只有在Treg細(xì)胞才發(fā)生了強(qiáng)烈的H3K4me3修飾，而在aTconv細(xì)胞中卻沒有；mRNA的表達(dá)水平與H3K4me3在啟動子區(qū)域的修飾程度一致。
　　第三部分：H3K

20、4me1在人Treg細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中的作用
　　1．高通量測序后通過對已知位點的QPCR檢測，結(jié)果顯示：在Treg細(xì)胞或者aTconv細(xì)胞的已知位點，會發(fā)生比較比較強(qiáng)烈的H3K4me1富集，但在陰性對照組中，則幾乎不發(fā)生H3K4me1的富集，驗證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；
　　2．ChIP樣品送往深圳華大基因研究所進(jìn)行高通量測序，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，得到了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me1的全基因組圖譜;
　　3．運

21、用生物信息學(xué)的方法首先從整體上比較了兩樣品的H3K4me1 peaks，發(fā)現(xiàn)：peaks的相關(guān)系數(shù)為0.48且在總共115391個H3K4me1 peaks中只有8897個共有的peaks；
　　4．選取了與Treg細(xì)胞功能密切相關(guān)的基因，例如FOXP3，IL2RA，CTLA及TNFRSF18,通過UCSC Genome Browser圖形化展示發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)：Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞之間，這些基因座上的H3K4me1修飾是差別

22、明顯的，但也存在少許的共有H3K4me1位點；
　　5．雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸3K4me1位點進(jìn)行功能鑒定，發(fā)現(xiàn)5個候選的H3K4me1位點中，只有2個在Jurkat細(xì)胞中有增強(qiáng)子的活性，而另外3個則沒有明顯的增強(qiáng)子活性；同時也發(fā)現(xiàn)，有2個Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞共有的H3K4me1位點，在Jurkat細(xì)胞都顯示了明顯的增強(qiáng)子活性；
　　6．通過生物信息學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)：Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞中，H3K4me1

23、 peaks和H3K4me3 peaks的相關(guān)性分別為0.16和0.19；同時還發(fā)發(fā)現(xiàn)，在Treg細(xì)胞中，僅僅有5030個位點是同時被H3K4me1和H3K4me3修飾，而在aTconv細(xì)胞中，也僅僅有7063個位點被同時修飾。
　　結(jié)論：
　　1．本研究采用MACS+FACS的方法得到了足夠數(shù)量并且極高純度的Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞，從而為下一步實驗奠定了非常堅實的基礎(chǔ)，也為關(guān)于Treg細(xì)胞的其他方面研究建立了一個非

24、常好的平臺；
　　2．我們首次繪制并比較了Treg細(xì)胞和aTconv細(xì)胞H3K4me3修飾的全基因組圖譜，發(fā)現(xiàn)這兩類細(xì)胞間H3K4me3修飾，特別是位于近端啟動子區(qū)域的H3K4me3修飾，變化不大；但是在某些Treg細(xì)胞特異性或者高表達(dá)的基因(例如FOXP3和CCR7)的啟動子上，H3K4me3修飾卻只發(fā)生在Treg細(xì)胞上。QPCR結(jié)果顯示mRNA的表達(dá)水平與H3K4m3在啟動子上的修飾程度一致。這些結(jié)果提示我們：表觀遺傳可能通過