Colivelin拮抗淀粉樣β蛋白所致大鼠記憶損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)和記憶能力喪失、智力下降，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆。目前，全世界約有3600萬(wàn)AD患者，據(jù)ADI估計(jì)這個(gè)數(shù)字以每20年翻一倍的速度增長(zhǎng)，到2030年將會(huì)達(dá)到6600萬(wàn)人。我國(guó)AD患者目前超過(guò)500萬(wàn)，并且隨著人口老齡化速度和程度的加劇，我國(guó)AD的發(fā)病率和患者總數(shù)還將持續(xù)增加。毫無(wú)疑問(wèn)，AD已成為21世紀(jì)威脅人類

2、的最嚴(yán)重疾病之一，是繼心血管疾病、腦血管疾病和癌癥之后嚴(yán)重影響老年人身體健康和人類壽命的“第四大殺手”。
　　 AD典型病理特征之一是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑。研究表明，老年斑的主要成分是由39-43個(gè)氨基酸組成的淀粉樣β蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)。全長(zhǎng)Aβ片段的神經(jīng)毒性作用已有廣泛報(bào)道，在此基礎(chǔ)之上，有大量實(shí)驗(yàn)表明Aβ25-35是全長(zhǎng)Aβ分子中一個(gè)較短的活性片段。本研究室在以往的研究中也發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35

3、能在細(xì)胞培養(yǎng)、離體膜片鉗和在體電生理實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出與全長(zhǎng)Aβ類似的神經(jīng)毒性作用。這些研究提示，拮抗Aβ神經(jīng)毒性作用可能是治療AD的一個(gè)有效手段。然而，迄今為止針對(duì)Aβ的AD治療尤其是有效拮抗Aβ神經(jīng)毒性作用的藥物研究，仍然沒(méi)有突破性進(jìn)展。
　　 Humanin(HN)是日本學(xué)者于2001年首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)由24個(gè)氨基酸組成的線性多肽，能夠特異性抑制AD及其各種相關(guān)損傷引起的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。Colivelin是由日本學(xué)者于2005年首

4、次報(bào)道的一種新的、由26個(gè)氨基酸組成的HN衍生物。目前有部分研究顯示，Colivelin有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠有效逆轉(zhuǎn)Aβ在原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的神經(jīng)毒性。然而，對(duì)于Colivelin在整體動(dòng)物中的作用，尤其是對(duì)學(xué)習(xí)記憶的電生理模型長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的影響及Colivelin保護(hù)作用的機(jī)制的研究還處于起步階段。
　　 Morris水迷宮(Morris wate

5、r maze，MWM)是用來(lái)衡量動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，能夠有效反映動(dòng)物的認(rèn)知功能改變，因而被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能包括AD動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試研究。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation，LTP)是由高頻刺激(high-frequency stimulus，HFS)所引發(fā)的一種興奮性突觸傳遞效能長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)增強(qiáng)的現(xiàn)象。鑒于海馬是AD發(fā)病過(guò)程中最早和最易受累的腦區(qū)之一，且海馬LTP的傷害與動(dòng)物認(rèn)知缺損高度相

6、關(guān)，海馬LTP特別是在體LTP已被視為研究學(xué)習(xí)記憶和AD發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要的電生理細(xì)胞模型而受到普遍關(guān)注。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)采用海馬內(nèi)分別給予Aβ25-35、生理鹽水、Colivelin(0.2nmol)和Colivelin(0.2pmol、2pmol、0.2nmol)+Aβ25-35的方法，觀察了Colivelin對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并探討其對(duì)于Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能損傷的逆轉(zhuǎn)作用。實(shí)驗(yàn)研究分為以下兩部分：(1)

7、利用國(guó)際公認(rèn)的經(jīng)典的Morris水迷宮測(cè)試手段，觀察Colivelin預(yù)處理是否能有效拮抗大鼠Aβ所致的學(xué)習(xí)記憶傷害；(2)利用在體海馬LTP記錄手段，觀察海馬內(nèi)注射Colivelin預(yù)處理對(duì)于Aβ25-35引起的LTP壓抑的作用，進(jìn)一步闡明Colivelin神經(jīng)保護(hù)作用的突觸前、后機(jī)制。通過(guò)以上兩部分研究，為Colivelin參與神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)提供充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，從而為保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ神經(jīng)毒性傷害，為預(yù)防和治療AD提供新的思路和理

8、論依據(jù)。
　　 第一部分：Colivelin部分逆轉(zhuǎn)Aβ25-35引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能損害
　　 目的：
　　 利用Morris水迷宮測(cè)定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，觀察海馬內(nèi)給予Aβ25-35、生理鹽水、Colivelin以及合用Colivelin和Aβ25-35后大鼠在Morris水迷宮中的行為學(xué)表現(xiàn)，探討Colivelin預(yù)處理對(duì)Aβ引起的空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷可能的作用。
　　 方法：
　　

9、 取運(yùn)動(dòng)靈活、無(wú)視力障礙的成年雄性SD大鼠(200-230g)隨機(jī)分組，進(jìn)行Morris水迷宮定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。主要指標(biāo)包括大鼠尋找平臺(tái)的平均逃避潛伏期和游泳距離、撤離平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間（限定時(shí)間為：120秒）和距離。同時(shí)，測(cè)定各組大鼠的游泳速度及大鼠的視力，以排除運(yùn)動(dòng)能力與視力障礙對(duì)測(cè)定指標(biāo)的影響。各種藥物均經(jīng)海馬內(nèi)注射給予，恢復(fù)2-3周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　

10、 (1)對(duì)照組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能正常。逃避潛伏期在訓(xùn)練第1-5天內(nèi)分別為79.0±3.3s,36.6±3.0s，20.2±2.0s，19.9±1.3s和16.5±1.7s；大鼠找到平臺(tái)所游過(guò)的距離分別為1427.5±135.1cm，689.4±80.8cm,369.2±50.7cm,322.4±40.6cm和265.3±44.0cm;撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游泳所用時(shí)間和距離分別為55.4±3.Os和1150.4±63.9cm。
　

11、　 (2)海馬內(nèi)注射4nmolAβ25-35后顯著降低了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。Aβ25-35海馬內(nèi)注射組大鼠的平均潛伏期和游過(guò)距離在第1天與對(duì)照組沒(méi)有明顯差別，在第2-5天分別為52.8±4.3s,39.5±1.6s，29.3±2.6s，26.8±1.4s和899.1±108.9cm,551.7±54.9cm,448.5±68.7cm,369.6±28.6cm，與對(duì)照組相比，其平均潛伏期明顯延長(zhǎng)，游過(guò)距離明顯縮短（P<0.01或P

12、<0.05）；撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游泳所占時(shí)間和距離顯著縮短，分別為36.8±2.9s和756.9±52.9cm（P<0.01）。
　　 (3)海馬內(nèi)單獨(dú)注射0.2nmol Colivelin后，大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能與對(duì)照組相比均未受到影響(P＞0.01)，分別為35.3±4.4s，22.1±2.9s,21.4±2.6s,19.4±0.7s和670.0±90.6cm,398.3±80.9cm,357.2±51.5cm,260

13、.0±37.0cm，撤掉平臺(tái)后在目標(biāo)象限游泳所用的時(shí)間和距離為55.0±3.0s和1148±63.1cm，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別(P＞0.01)。但聯(lián)合給予Colivelin(0.2pmol，2pmol，02nmol)與Aβ25-35后，與Aβ25-35組相比，各組平均潛伏期和游過(guò)距離兩個(gè)指標(biāo)在第2-5天都有縮短現(xiàn)象，0.2pmol Colivelin+Aβ25-35組(n=11)2-5天找到平臺(tái)所用的時(shí)間和距離分別為45.4±3.5s

14、,33.9±1.7s,24.6±3.8s,22.3±1.9s和728.0±78.3cm,425.1±43.8cm,339.9±84.4cm，286.1±41.5cm;在2pmol Colivelin+Aβ25-35組(n=12)分別為33.8±3.8s，29.8±2.1s,22.0±1.6s,20.0±1.6s和582.1±115.2cm,385.6±59.1cm,281.5±33.3cm,228.8±27.3cm;在0.2nmol C

15、olivelin+Aβ25-35組(n=12)，分別為28.1±2.4s，20.8±2.1s，19.3±1.6s,17.9±2.4s和509.5±63.6cm,302.9±56.7cm,247.9±28.8cm,203.8±47.9cm與Aβ25-35組相比均有明顯縮短(P<0.01)，并且這種逆轉(zhuǎn)作用具有劑量依賴性。撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限游泳所用時(shí)間和距離實(shí)驗(yàn)中，0.2pmol Colivelin+Aβ25-35組為39.1±2.1

16、s和799.0±74.0cm;2pmol Colivelin+Aβ25-35組為43.8±3.0s和934.9±53.8cm;0.2nmol Colivelin+Aβ25-35組為54.0±3.7s和1148.4±63.0cm，與Aβ25-35組相比均有并不同程度的增加，并且這種增加呈現(xiàn)出劑量依賴性。
　　 (4)各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期和游泳速度均無(wú)顯著區(qū)別。
　　 結(jié)論：
　　 海馬內(nèi)注射Aβ

17、25-35能夠傷害大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，單獨(dú)使用Colivelin不會(huì)對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶活動(dòng)造成影響，但Colivelin預(yù)處理之后給予Aβ25-35，發(fā)現(xiàn)Colivelin可部分逆轉(zhuǎn)Aβ對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損傷作用，并且此逆轉(zhuǎn)作用具有劑量依賴性。
　　 第二部分：Colivelin拮抗Aβ25-35引起的大鼠在體海馬LTP損害
　　 目的：
　　 通過(guò)海馬內(nèi)注射Colivelin以及Aβ25-35后記錄海

18、馬場(chǎng)興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)，研究不同劑量Colivelin預(yù)處理之后對(duì)Aβ25-35壓抑大鼠海馬CA1區(qū)在體LTP的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用海馬內(nèi)注射給藥后已行水迷宮測(cè)試的SD大鼠，麻醉后將其固定在腦立體定位儀上，將綁定好的刺激電極和記錄電極精確插入到海馬刺激和記錄部位。通過(guò)給予海馬S

19、chaffer側(cè)枝單個(gè)電刺激、強(qiáng)直電刺激和雙脈沖刺激，在海馬CA1區(qū)放射層誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)的fEPSPs、強(qiáng)直刺激引起的LTP，以及配對(duì)脈沖引起的雙脈沖易化(paired pulse facilitation,PPF).
　　 結(jié)果：
　　 (1)Aβ25-35不影響基礎(chǔ)性突觸傳遞，但對(duì)于高頻刺激引起的LTP具有明顯的壓抑作用。給予HFS后0min,30min，60min，對(duì)照組fEPSPs幅度增強(qiáng)至176.8±4.1％，

20、150.6±2.8％和141.3±2.3%;4nmol Ap25-35組的fEPSPs幅度分別只有166.6±3.0%，116.2±1.6和106.2±2.8%;表明Aβ25-35片段可明顯壓抑海馬CA1區(qū)LTP(P<0.01)。
　　 (2)單獨(dú)給予0.2nmol Colivelin后，基礎(chǔ)性突觸傳遞和LTP都沒(méi)有發(fā)生明顯改變。其在給予HFS后0min,30min，60min時(shí)分別為：178.5±2.9%，139.9±2.9%

21、，138.5±2.1%。給予Colivelin(0.2pmol，2pmol,0.2nmol)預(yù)處理后，再給予Aβ25-35，在0.2pmol Colivelin+Aβ25-35組，其數(shù)值分為為：164.5±1.8％，122.4±1.9%，110.3±1.1%；在2pmol Colivelin+Aβ25-35組中，數(shù)值分別為：166.0±2.3%，132.2±2.1%，119.2±1.2%;在0.2nmol Colivelin+Aβ25-

22、35組中則分別為：178.7±2.8%，139.8±2.4%，126.0±2.6%。LTP值在HFS后0min,30min和60min時(shí)的數(shù)值均高于單獨(dú)給予Aβ25-35LTP(P<0.01)，并且差別具有劑量依賴性。表明Colivelin能夠劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)AD對(duì)LTP的傷害作用。
　　 (3)對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的PPF都沒(méi)有顯著差異，提示所用各種藥物影響LTP主要不是通過(guò)突觸前機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。
　　 結(jié)論：