Fucoidan對(duì)β淀粉樣蛋白和d-gal聯(lián)合誘導(dǎo)PC12細(xì)胞和小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為記憶和其他認(rèn)知功能的喪失?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，AD發(fā)病主要與β-淀粉樣肽25～35(Aβ25～35)在腦組織異常沉積、腦內(nèi)神經(jīng)血管單元功能異常導(dǎo)致Aβ25～35清除障礙、膽堿能神經(jīng)元受損、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥反應(yīng)或基因突變等因素有關(guān)。Fucoidan是富含巖藻糖和硫酸酯基的水溶性雜聚糖，目前發(fā)現(xiàn)僅存在于褐藻和某些棘皮動(dòng)物，如海

2、參、海膽體內(nèi)，而褐藻來(lái)源的Fucoidan具有獨(dú)特的分支結(jié)構(gòu)，并且不同種屬具有不同比例的半乳糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等。Fucoidan具有抗衰老、抗凝血、抗血栓、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性，是重要的海洋藥源物質(zhì)。
　　本實(shí)驗(yàn)研究Fucoidan對(duì)Aβ25～35和D-gal聯(lián)合應(yīng)用致PC-12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，檢測(cè)與衰老相關(guān)的生化指標(biāo)和與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白的變化;采用D-gal用藥誘導(dǎo)建立衰老小鼠模型，研究Fucoidan對(duì)衰老小鼠

3、學(xué)習(xí)記憶的改善作用和機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用乙醇分級(jí)沉淀法從粗品Fucoidan中純化獲得Fucoidan。
　　2.采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、自動(dòng)指示旋光儀、核磁共振儀分別測(cè)定Fucoidan的總糖含量、糖醛酸含量、旋光度和官能團(tuán)。
　　3.凝聚態(tài)Aβ25～35和D-gal的制備，采用酶學(xué)檢測(cè)、Westem blot、流式細(xì)胞術(shù)得到最佳藥物濃度為25μM&10mM。
　　4.MTT檢測(cè)Fuc

4、oidan細(xì)胞毒性作用。
　　5.光學(xué)顯微鏡和Hoechst33258染色觀察觀察細(xì)胞的外部形態(tài)和凋亡細(xì)胞核形態(tài)。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fucoidan對(duì)細(xì)胞的影響。
　　7.采用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中caspase3、caspase3/17p、caspase8、caspa7e9、CytC和Livin、XIAP在蛋白水平以及酶學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞中SOD活力和GSH的含量。
　　8.建立D-gal衰老

5、模型，動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，酶學(xué)檢測(cè)組織中SOD和AChE的活力，GSH和ChAT含量，尼氏染色檢測(cè)尼氏小體數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.Fucoidan的得率為38.91％。
　　2.Fucoidan總糖含量、硫酸基團(tuán)含量、糖醛酸含量、分子量和旋光度分別為44.7％、18.5％、12.5％、26.61×104Da和0.99°(20℃)
　　3.隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞的存活率下降，與Control組相比，Aβ&D-ga

6、l(15μM&10mM、20μM&10mM、25μM&10mM、30μM&10mM)在處理36h、48h、72h后細(xì)胞的存活率下降。酶學(xué)檢測(cè)、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)得到藥物濃度為10mM&25μM，處理時(shí)間為48h誘導(dǎo)效果最佳。
　　4.Fucoidan處理細(xì)胞24h后，各組細(xì)胞和用藥組細(xì)胞相比，細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明Fucoidan沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性作用。
　　5.Fucoidan保護(hù)細(xì)胞24h后，

7、Fucoidan各組與對(duì)照組相比，細(xì)胞神經(jīng)絲的長(zhǎng)度有所恢復(fù)，細(xì)胞密度增大。PC12細(xì)胞逐步呈現(xiàn)彌漫均勻的低熒光強(qiáng)度，出現(xiàn)了正常細(xì)胞的特征，說(shuō)明Fucoidan能夠有效的減少細(xì)胞凋亡，使凋亡細(xì)胞顯著減少。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞的存活率明顯下降。
　　6.Fucoidan處理細(xì)胞24h后，F(xiàn)ucoidan各組與對(duì)照組相比，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的數(shù)量比明顯下降。
　　7.Fucoidan保護(hù)細(xì)胞24h后，200μg/mL，4

8、00μg/mL組的caspase3、caspase8、caspase9、CytC的表達(dá)量明顯下降，Livin、XIAP的表達(dá)量明顯上升。Fucoidan各組細(xì)胞的SOD的活力和GSH的含量顯著提高。
　　8.水迷宮結(jié)果顯示，用藥組Fucoidan100mg/kg和200mg/kg組與模型組相比，小鼠找到平臺(tái)的潛伏期明顯縮短。腦組織中GSH，Ach的含量，ChAT的活性上升，AChE活性下降。血清中SOD活力和GSH含量增加，F(xiàn)uc