Fucoidan對β淀粉樣蛋白和d-gal聯(lián)合誘導PC12細胞和小鼠學習記憶能力損傷的保護作用.pdf

1、目的:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為記憶和其他認知功能的喪失?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，AD發(fā)病主要與β-淀粉樣肽25～35(Aβ25～35)在腦組織異常沉積、腦內(nèi)神經(jīng)血管單元功能異常導致Aβ25～35清除障礙、膽堿能神經(jīng)元受損、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥反應(yīng)或基因突變等因素有關(guān)。Fucoidan是富含巖藻糖和硫酸酯基的水溶性雜聚糖，目前發(fā)現(xiàn)僅存在于褐藻和某些棘皮動物，如海

2、參、海膽體內(nèi)，而褐藻來源的Fucoidan具有獨特的分支結(jié)構(gòu)，并且不同種屬具有不同比例的半乳糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等。Fucoidan具有抗衰老、抗凝血、抗血栓、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性，是重要的海洋藥源物質(zhì)。
　　本實驗研究Fucoidan對Aβ25～35和D-gal聯(lián)合應(yīng)用致PC-12細胞損傷的保護作用，檢測與衰老相關(guān)的生化指標和與細胞凋亡相關(guān)的蛋白的變化;采用D-gal用藥誘導建立衰老小鼠模型，研究Fucoidan對衰老小鼠

3、學習記憶的改善作用和機制。
　　方法:
　　1.采用乙醇分級沉淀法從粗品Fucoidan中純化獲得Fucoidan。
　　2.采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、自動指示旋光儀、核磁共振儀分別測定Fucoidan的總糖含量、糖醛酸含量、旋光度和官能團。
　　3.凝聚態(tài)Aβ25～35和D-gal的制備，采用酶學檢測、Westem blot、流式細胞術(shù)得到最佳藥物濃度為25μM&10mM。
　　4.MTT檢測Fuc

4、oidan細胞毒性作用。
　　5.光學顯微鏡和Hoechst33258染色觀察觀察細胞的外部形態(tài)和凋亡細胞核形態(tài)。
　　6.流式細胞術(shù)檢測Fucoidan對細胞的影響。
　　7.采用Western blot方法檢測細胞中caspase3、caspase3/17p、caspase8、caspa7e9、CytC和Livin、XIAP在蛋白水平以及酶學方法檢測細胞中SOD活力和GSH的含量。
　　8.建立D-gal衰老

5、模型，動物行為學實驗，酶學檢測組織中SOD和AChE的活力，GSH和ChAT含量，尼氏染色檢測尼氏小體數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.Fucoidan的得率為38.91％。
　　2.Fucoidan總糖含量、硫酸基團含量、糖醛酸含量、分子量和旋光度分別為44.7％、18.5％、12.5％、26.61×104Da和0.99°(20℃)
　　3.隨著藥物濃度的升高，細胞的存活率下降，與Control組相比，Aβ&D-ga

6、l(15μM&10mM、20μM&10mM、25μM&10mM、30μM&10mM)在處理36h、48h、72h后細胞的存活率下降。酶學檢測、Western blot、流式細胞術(shù)得到藥物濃度為10mM&25μM，處理時間為48h誘導效果最佳。
　　4.Fucoidan處理細胞24h后，各組細胞和用藥組細胞相比，細胞的存活率沒有顯著性差異，說明Fucoidan沒有明顯的細胞毒性作用。
　　5.Fucoidan保護細胞24h后，

7、Fucoidan各組與對照組相比，細胞神經(jīng)絲的長度有所恢復，細胞密度增大。PC12細胞逐步呈現(xiàn)彌漫均勻的低熒光強度，出現(xiàn)了正常細胞的特征，說明Fucoidan能夠有效的減少細胞凋亡，使凋亡細胞顯著減少。流式細胞實驗結(jié)果顯示，細胞的存活率明顯下降。
　　6.Fucoidan處理細胞24h后，F(xiàn)ucoidan各組與對照組相比，細胞早期凋亡和晚期凋亡的數(shù)量比明顯下降。
　　7.Fucoidan保護細胞24h后，200μg/mL，4

8、00μg/mL組的caspase3、caspase8、caspase9、CytC的表達量明顯下降，Livin、XIAP的表達量明顯上升。Fucoidan各組細胞的SOD的活力和GSH的含量顯著提高。
　　8.水迷宮結(jié)果顯示，用藥組Fucoidan100mg/kg和200mg/kg組與模型組相比，小鼠找到平臺的潛伏期明顯縮短。腦組織中GSH，Ach的含量，ChAT的活性上升，AChE活性下降。血清中SOD活力和GSH含量增加，F(xiàn)uc