腦通湯對缺氧-復(fù)氧損傷腦微血管內(nèi)皮細胞和海馬神經(jīng)元的保護作用及機制的研究.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　以體外腦微血管內(nèi)皮細胞、海馬神經(jīng)元為基礎(chǔ)，通過制備缺氧/復(fù)氧模型模擬腦缺血再灌注損傷，以腦通湯為干預(yù)因素，觀察腦微血管內(nèi)皮細胞ICAM-1、EBA蛋白及ICAM-1、NF-kB、COX-2mRNA等基因水平;海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白及Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA等基因水平的影響，旨在探討腦通湯對缺氧/復(fù)氧損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞、海馬神經(jīng)元的保護作用及機制。
　　實驗方法：
　　

2、1、原代培養(yǎng)及鑒定腦微血管內(nèi)皮細胞和海馬神經(jīng)元原代分離、培養(yǎng)，分別用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)鑒定腦微血管內(nèi)皮細胞及海馬神經(jīng)元的純度。
　　2、制備腦通湯含藥血清SD大鼠隨機分為腦通湯大、中、小劑量組及正常對照組共四組，分別灌胃腦通湯大、中、小劑量(15.2、7.6、3.8g.kg-1.d-1)，正常對照組灌服生理鹽水10ml.kg-1.d-1)，一天2次，連灌4d，末次灌胃2h后，股動脈采血，離心，分

3、離血清，過濾，滅活，分裝，標(biāo)記，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>　　3、細胞分組與建立缺氧/復(fù)氧模型將腦微血管內(nèi)皮細胞和海馬神經(jīng)元各隨機分為6組，分別為:正常細胞組、（缺氧/復(fù)氧）模型組、正常血清組、腦通湯大、中、小劑量含藥血清組。造模的兩種細胞除正常細胞組以外，其余各組分別在缺氧時依次加入含10％的正常血清培養(yǎng)基和10％不同劑量的腦通湯含藥血清培養(yǎng)基進行干預(yù)，置入37℃三氣培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入(95％N2+5％C02)混合氣體缺氧24h;

4、在復(fù)氧時依次全量換液上述相應(yīng)的培養(yǎng)基，再放回37℃、5％C02培養(yǎng)箱復(fù)氧2h，制備細胞缺氧24h再復(fù)氧2h模型。
　　4、①MTT比色法測定腦微血管內(nèi)皮細胞和海馬神經(jīng)元缺氧24h復(fù)氧2h時間點的活性及存活率。②免疫組化法檢測:腦微血管內(nèi)皮細胞ICAM-1、EBA蛋白和海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白陽性細胞平均光密度值表達。③實時熒光定量PCR法檢測:腦微血管內(nèi)皮細胞ICAM-1、NF-kB、COX-2mRNA和海馬神經(jīng)元Bcl-

5、2、Bax、 Caspase-3mRNA的表達。
　　實驗結(jié)果:
　　1、倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察
　　腦微血管內(nèi)皮細胞生長7-9天后融合，呈現(xiàn)典型的“鵝卵石樣”密集的排列。傳代后細胞形態(tài)以長梭形為主，第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定陽性，證明培養(yǎng)的細胞為腦微血管內(nèi)皮細胞。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)8-9d后胞體飽滿，完全成熟，神經(jīng)元突起之間緊密連接成稠密網(wǎng)絡(luò)狀，可見少許的細胞碎片，NSE免疫熒光染色鑒定海馬神經(jīng)元純度為94.5％±2.

6、5％。
　　2、成功制備不同劑量腦通湯含藥血清
　　將其配制成10％（體積分?jǐn)?shù)）的SD大鼠正常血清培養(yǎng)基和10％不同劑量的腦通湯含藥血清培養(yǎng)基，4℃冰箱凍存。
　　3、成功復(fù)制缺氧24h再復(fù)氧2h細胞模型
　　經(jīng)過MTT比色法發(fā)現(xiàn)24h和2h為本實驗的最佳缺氧和復(fù)氧時間點。
　　4、MTT比色法顯示
　　與正常細胞組比較，模型組腦微血管內(nèi)皮細胞、海馬神經(jīng)元活性及存活率明顯下降(P＜0.05)。與模型組

7、比較，不同劑量腦通湯含藥血清組干預(yù)后，可以顯著增加腦微血管內(nèi)皮細胞、海馬神經(jīng)元的活性及存活率(P＜0.05);但正常血清組兩種細胞的活性及存活率無顯著差異(p＞0.05)。
　　5、免疫組化顯示
　　①腦微血管內(nèi)皮細胞:與正常細胞組比較，模型組ICAM-1蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，而EBA蛋白表達明顯下降(P＜0.05)。與模型組比較，不同劑量腦通湯含藥血清組，ICAM-1蛋白表達明顯下調(diào)(P＜0.05)、EBA蛋白

8、表達顯著上調(diào)(P＜0.05);但正常血清組ICAM-1、EBA蛋白表達無顯著差異(p＞0.05)。②海馬神經(jīng)元:與正常細胞比較，模型組Bcl-2蛋白表達下降、Bax蛋白表達明顯升高、Bcl-2/Bax比值下調(diào)(P＜0.05)。與模型組比較，腦通湯大、中、小劑量含藥血清組，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯增高，Bax蛋白表達明顯下降，腦通湯大劑量含藥血清組上述指標(biāo)表達最顯著(P＜0.05);但正常血清組上述指標(biāo)無顯著變化(p

9、＞0.05)。
　　6、實時熒光定量PCR顯示
　?、倌X微血管內(nèi)皮細胞:與正常細胞組比較，模型組ICAM-1、NF-kB、COX-2mRNA的相對表達量明顯升高(P＜0.05)。與模型組比較，正常血清組及不同劑量腦通湯含藥血清組，ICAM-1、NF-KB、COX-2mRNA的相對表達量明顯下調(diào)(P＜0.05)。②海馬神經(jīng)元:Bcl-2mRNA、BaxmRNA相對表達量表達的趨勢和Bcl-2、Bax蛋白趨勢一致，Caspase

10、-3mRNA的相對表達量表達與Bax蛋白一致。
　　7、所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計和方差分析。
　　實驗結(jié)論：
　　1、本實驗建立的大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞、海馬神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧模型能很好的模擬腦缺血再灌注損傷。
　　2、腦通湯對缺氧/復(fù)氧損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞具有保護作用，其保護機制，一方面，與本方能抑制缺氧/復(fù)氧損傷時由NF-kB信號通路介導(dǎo)下游靶基因ICAM-1及COX-2的釋放與轉(zhuǎn)錄，減輕其