中度創(chuàng)傷性腦損傷對海馬內未成熟神經元作用機制的研究.pdf

1、研究背景和目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)不僅導致皮層細胞死亡,也會誘導繼發(fā)性海馬細胞死亡。創(chuàng)傷性腦損傷是神經外科常見病,在我國年發(fā)病率為55.4人/10萬人口,并呈逐年上升趨勢。TBI常見的后遺癥包括外傷后癲癇和記憶障礙等,嚴重影響了患者的生活質量,這些后遺癥發(fā)生的神經學基礎尚不清楚。單側的打擊可以通過腦組織傳遞到對側,但是在通過腦組織和其他顱內組織時壓力顯著減小,所以液壓打擊對對側腦組織的影

2、響較小。以前已有報道創(chuàng)傷性腦損傷誘導的海馬區(qū)高興奮性,但是多數研究集中在對海馬齒狀回創(chuàng)傷后神經網絡改變的研究。針對齒狀回創(chuàng)傷后出現的高興奮性,人們提出了不同理論。Lowenstein等發(fā)現,對單側腦半球的打擊可引起海馬齒狀回顆粒細胞的高興奮性和表達生長抑素的海馬齒狀回門(hi-1ar)細胞的減少,提出了齒狀回門細胞的“選擇性易損傷”學說。Santhakumar等認為,創(chuàng)傷后齒狀回門中間神經元并沒有選擇性易損傷,認為門結構對于損傷后齒狀回

3、顆粒細胞活動的加強是必需的,創(chuàng)傷后門結構中的苔蘚細胞對來自perforant通路的刺激反應增強,由此提出了“易激惹苔蘚細胞”假說。因此,海馬齒狀回一直被認為濾過異常傳入信號進入CA3區(qū)的一道屏障,CA3區(qū)將傳入的信號進行擴大,然后通過CA1區(qū)將信號傳遞到大腦皮層。因此,在CA3和CA1之間進行切斷,有助于減少創(chuàng)傷后來自齒狀回的異常上位傳入信號對CA1區(qū)神經元興奮性的影響,更易于相對獨立研究CA1區(qū)的Schaffer側支單突觸傳遞通路。<

4、br>　　 腦損傷是神經外科醫(yī)師工作中常見的問題,多見于機械性撞擊、交通事故、暴力侵害造成。腦損傷不但奪去為數不少人的生命,而且還造成大量腦外傷后遺癥,構成對患者家庭及社會的沉重負擔。建立腦損傷(TBI)動物模型的方法主要有兩大類:液壓沖擊模型(FP)和控制性腦皮質撞擊模型(IC)。腦損傷除造成腦結構形態(tài)破壞,缺氧缺血神經細胞壞死外,尚可發(fā)生大量神經細胞凋亡。眾所周知,神經細胞凋亡不同于壞死,它是正常生理狀態(tài)下細胞死亡模式。海馬結構具

5、有高度有序化的板層且各種神經成分相對獨立分布,可作為研究腦的理想模型。海馬結構由海馬、齒狀回、下托(subiculum)、束狀回和灰被組成。它從室間孔處延至側腦室下角頂部,全形呈弓形,屬古皮質。以胼胝體為標志可把海馬結構分成上、下部。海馬皮質可分為多形層、錐體層和分子層。錐體細胞規(guī)則排列的形式決定了整個海馬的結構模式。就整體來講海馬的結構是比較一致的,但依據細胞構筑的不同可再將其劃分成四個區(qū),分別命名為CA1、CA2、CA3和CA4區(qū),

6、“CA"是Am-mon角(cornu ammonis)的縮寫。CA4緊鄰齒狀回,CA1與下托相連接。海馬在人類和實驗動物模型中是TB1后最脆弱的腦部區(qū)域之一。海馬結構是研究較多的與學習記憶有關的腦區(qū),它不僅和陳述記憶有關,而且還涉及認知功能和位置導航,是一個重要的信息處理部位。大量研究已證明與學習記憶特別是空間認知功能有關。尤其CA3區(qū)被認為與空間辨別性學習記憶活動的關系尤為密切。在動物實驗中,人們發(fā)現損毀海馬能促進操作性逃避的學習,但

7、可減弱在“T”迷宮逃避足部電擊的視覺辨別問題的學習。也有實驗結果表明,海馬突觸體內游離鈣特異性的升高與動物學習記憶的減退相一致。雙側海馬損傷的患者,當他們在一段時間內集中注意力,雖可記住一個短句或一個短位數字,但當患者把注意力轉向某些其它事物時,即使是片刻,也將完全忘記這個短句或短位數字。這種障礙使患者不能學習新事物,也不能記憶最近的經歷,但對發(fā)病前獲得的技能以及生活中曾發(fā)生的事情,仍有良好記憶。海馬與記憶有著密切的聯系,海馬通過腦干網

8、狀結構系統(tǒng)及皮質下行纖維接受來自視、聽、觸、痛等多種感覺信息,并參與調節(jié)內分泌活動。
　　 我們之前發(fā)現,中度TBI后,海馬中多數死亡細胞主要僅限于海馬齒狀回,海馬齒狀回內神經形成在整個生命周期內都是持續(xù)不斷的。細胞類型和細胞生成分析發(fā)現,海馬齒狀回內死亡的細胞是新生2～3周的未成熟顆粒神經元。1973年Bliss第一次發(fā)現在家兔海馬齒狀回具有強直刺激引起突觸功效的強直后增強現象,當用短串高頻電刺激海馬的興奮性傳入神經時,海馬突

9、觸傳遞可在數秒鐘內增強,且持續(xù)時間在10h以上,特稱之為長時程增強(LTP)。LTP是突觸活動的易化現象,被視為突觸可塑性的一個模式,習慣上把具有這種性質的突觸稱為可塑性突觸。肖鵬等進一步驗證了LTP出現的快慢與條件反應建立的快慢(個體差異)相吻合,即在明暗辨別學習中出現突觸效應長時程增強,保持時間的長短與鞏固性訓練的多少呈正相關,且LTP消退,習得性行為也消退。結果發(fā)現,在條件反應的建立過程中,產生突觸效應LTP；在條件反應的鞏固過程

10、中,LTP繼續(xù)保持；當條件反應消退,LTP也消退；在條件反應的再建立過程中,再次產生LTP,而且這種習得性LTP的發(fā)展和變化超前于習得性行為的產生和改變。以上資料表明LTP可能是學習記憶的神經基礎,特別在運動學習過程中對新的神經回路的形成起著重要作用。本研究結果表明,TBI后大多數的新生神經死亡發(fā)生在24h內,然后在一個低水平保持至少2w。死亡的未成熟粒細胞多數沒有表現出細胞凋亡形態(tài)特征,凋亡標記物幾乎顯示陰性。相反,他們共同表達受體相

11、互作用蛋白(RIP-1,一種壞死標記物)顯示未成熟的神經細胞因壞死而死亡。從而表明,中度TBI可引發(fā)海馬內未成熟神經元的快速壞死性死亡。學習記憶是神經系統(tǒng)特別是中樞神經系統(tǒng)各部相互作用,共同完成的復雜過程。不僅依賴于神經元構成的復雜網絡性的多層次神經元環(huán)路,而且還依賴于環(huán)路中每個神經元的神經介質的正常調節(jié)。研究顯示海馬結構與學習記憶,特別是空間辨別性學習記憶功能關系密切,海馬結構內構成了明確的突觸通路,海馬內突觸通路的完整對各類學習記憶

12、的功能是非常重要的。提示防止海馬內細胞死亡的治療應以未成熟神經細胞作為目標,在損傷后24h內給予治療,以阻斷細胞壞死過程。顱腦是人體最重要的器官,腦損傷后如何挽救尚有活力的神經細胞,減少遲發(fā)性死亡,盡量保護神經功能,是每一位神經科醫(yī)生都要面對的難題。近年來,分子生物學研究發(fā)現,海馬作為腦損傷后易損區(qū),出現神經細胞延遲性死亡。目前,國內外有關這一領域的研究大多局限于缺血性腦損傷,有關腦損傷后這一領域的研究機制尚無全面的報道。
　　

13、 聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(poly adenosinediphosphate ribose polymerase,PARP)被認為跟凋亡過程的啟動相關,在實驗鼠TBI后,PARP陽性細胞主要出現在海馬CA3區(qū)的錐體細胞層,海馬CA3區(qū)的錐體細胞層神經元在經典的海馬三突觸回路中有著重要作用和地位,無論是齒狀回顆粒細胞層.經苔狀纖維-投射至CA3區(qū)錐體細胞層,還是CA3區(qū)錐體細胞層.經謝弗側支.投射至CA1區(qū)錐體細胞層,都與CA3區(qū)錐體細胞

14、層相關聯,海馬三突觸回路是學習、記憶的基本結構,本實驗中,由于TBI致傷區(qū)域及海馬本身的形狀結構使得海馬CA3區(qū)錐體細胞層是間接受損較早且較嚴重的部位,因為海馬三突觸回路的受損,從而引起TBI后學習記憶能力的下降。
　　 研究方法:本實驗采用了美國杰克遜實驗室8～11周齡的雄性C57 BL/6小鼠48只,分組飼養(yǎng)并進行中度可控性大腦皮層損傷(隨機分為TBI術后4h,24h,48h,3d,7d和14 d,非手術組以及對照組共8組,

15、每組6只),摘除腦部并用4％多聚甲醛(PFA)固定過夜,然后用30％的蔗糖抗凍保存48h,用冰凍切片機(Microm HM500 M)進行連續(xù)冠狀切片(30μm)并于-20℃保存,隨后對切片進行Fluoro-Jade B染色、免疫組織化學分析、原位末端轉移酶標記(TUNEL)檢測、定量分析和統(tǒng)計分析,用連接數碼相機(Zeiss Axio CamMRc5,Carl Zeiss Microlmaging公司)的熒光顯微鏡(Zeiss Axi

16、overt200 M CarlZeiss MicroImaging公司)對切片進行分析。用成像軟件對圖像進行捕獲(Axio Vision,4.0,Carl Zeiss Microlmaging公司)并用Photoshop7.0進行組合與標記；觀察了中度創(chuàng)傷性腦損傷對小鼠海馬未成熟神經元學習和記憶能力的影響作用；探討了海馬結構的可塑性與學習記憶的相關性；證實了許多細胞因子和生化物質參與腦外傷后繼發(fā)性腦損傷與抗損傷的病理生理過程,堿性成纖維

17、細胞生長因子(bFGF)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)作為多種神經生長因子,可能與神經營養(yǎng)和再生、血管再生、創(chuàng)傷愈合等密切相關,能保護神經元對抗缺氧、低血糖、興奮性氨基酸、鈣超載、自由基和一氧化氮等多種損傷,防治和減少繼發(fā)性腦損害,提高腦損傷的救治效果；研究了對創(chuàng)傷性腦損傷海馬神經元死亡的量化評估,海馬作為大腦邊緣系統(tǒng),與記憶相關性的探討正成為研究的熱點,損傷引起遲發(fā)性神經元壞死是近年來備受關注的課題；表明了中度創(chuàng)傷性腦損傷會引發(fā)海

18、馬中不成熟神經元壞死性死亡,防止海馬內細胞死亡的治療方法應通過阻斷壞死的過程,并且以保護未成熟神經細胞作為治療目標,最好在損傷后2411內進行。
　　 研究結果
　　 1.中度創(chuàng)傷性腦損傷后海馬繼發(fā)性細胞死亡主要發(fā)生在顆粒細胞層.當我們通過一種廣泛用于死亡神經元染色的Fluoro-Jade B染色方法研究TBI24h后海馬內細胞死亡情況時,主要在病灶周圍區(qū)域和同側海馬內(圖1a)觀察到被FJB染成綠色的死亡細胞。海馬病灶

19、FJB-陽性細胞的平均數量為359±21 N/mm3。在對側皮層沒有觀察到FJB-陽性細胞。更高放大倍數的照片顯示,FJB-陽性細胞不是均勻地分布在海馬內-(圖1b-d),相反,他們主要位于海馬齒狀回(圖1 a-d)。海馬內不同區(qū)域由不同類型的細胞組成,它們可能對外傷性創(chuàng)傷有不同的敏感性。我們進一步評估了TBI24h后海馬內不同亞區(qū)內FJB-陽性細胞的分布。于TBI24h后,顆粒細胞層(GCL)有291±19 N/mm3 FJB-陽性細

20、胞,占海馬中死亡細胞總數的80.9％,然而在CA1有0.15％；在CA3有11.42％,在海馬門有5.04％,在分子層(MCL)有1.65％(圖1,餅狀圖e)。盡管海馬中FJB-陽性細胞總數明顯地從創(chuàng)傷性腦損傷后24h的359±21 N/mm3明顯地減少到3d后的55±3 N/mm3,創(chuàng)傷性腦損傷3d后的FJB-陽性細胞在海馬不同亞區(qū)的分布與創(chuàng)傷性腦損傷24h后的分布非常相似。顆粒細胞層(GCL)有80.02％,CA1有2-37％；CA

21、3有12.80％；海馬門有0.84％；在分子層(MCL)有0.96％(圖1,餅狀圖f)。為了評估沿海馬齒狀回的死亡細胞分布格局,我們量化了中心區(qū)域,以及中心區(qū)域頭端和尾端的FJB-陽性細胞密度。中心區(qū)域的死亡細胞密度最大,死亡細胞的密度向頭端和尾端方向慢慢降低(圖1 g)。
　　 2.創(chuàng)傷性腦損傷后齒狀回顆粒細胞層(GCL)神經元死亡的時域分布。在損傷后的最初4h,我們觀察到在齒狀回顆粒細胞層(GCL)有相當多數量的FJB-陽性

22、細胞(32008.5±5584.3 N/mm3,N=6),FJB-陽性細胞數量峰值出現在24h(38131.9±4858.2 N/mm3,N=6),48h急劇下降(9150.3±1763.8 N/mm3,N=6,P=0.008,與24 h組相比),第14d降到非常低的水平(第3d,5840.9±736.1 N/mm3,N=6；第7d,5945.0±1509.8 N/mm3,N=6；第14d,921.8±666.6N/mm3,N=6)(圖

23、2)。
　　 3.未成熟的新生神經元對創(chuàng)傷性腦損傷的耐受性。創(chuàng)傷性腦損傷后4h,在顆粒細胞層有大量的FJB-陽性細胞(圖3a,b,d,和e)。大多數的FJB-陽性細胞位于顆粒細胞層內三分之一處(圖3 a,b,d,和e),其中有大多數未成熟的新生顆粒神經元存在。正如預期,NeuN陽性成熟顆粒神經元位于顆粒細胞層高厚度方向上(圖3a),相反,NCAM陽性未成熟顆粒神經元位于顆粒細胞層內三分之一處(圖3d)。更高功率的圖像(圖3 b)

24、和三維重建圖像(圖3c)表明,大多數FJB-陽性細胞不與NeuN標記物共存,表明顆粒細胞層大部分FJB-陽性細胞不是成熟的顆粒神經元。相反,更高分辨率的圖像(圖3 b)和三維重建圖像(圖3c)表明,大部分FJB-陽性細胞與NCAM陽性細胞共存,表明中度創(chuàng)傷性腦損傷后4h顆粒細胞層的大部分死亡細胞是不成熟的顆粒神經元。創(chuàng)傷性腦損傷7d后,顆粒細胞層的FJB-陽性細胞的數量明顯減少(圖3 g和j),研究結果支持此結論,即齒狀回細胞死亡主要發(fā)

25、生在創(chuàng)傷性腦損傷后24h內,且創(chuàng)傷性損傷后24h后急劇減小。更高分辨率的圖像(圖3h)和三維重建圖像(圖3k)表明:大多數FJB-陽性細胞都不與NeuN共存,而是與NCAM陽性細胞共存。
　　 4.中度TBI后海馬細胞的死亡類型主要是壞死。我們在對側海馬沒有觀察到顯著的RIP-1表達(圖6 a,c,e),然而,在同側的海馬區(qū)的FJB-陽性顆粒細胞有顯著的RIP-1表達(圖6b,d,f),合并后的圖像顯示,FJB-陽性細胞(圖6b

26、)與RIP-1信號同時存在(圖6 f),用三維重建技術和高倍放大的圖像可見FJB-陽性細胞高度表達的RIP-1(圖6g-j)。定量分析表明,在FJB-陽性細胞中,有78.6±5.1％的細胞同時表達了RIP-1,這意味著有高比例的細胞死于壞死死亡,這些結果可作為創(chuàng)傷性腦損傷后海馬內未成熟神經元壞死死亡的支持證據。在CA1區(qū)觀察到大量裂解的活性caspase-3陽性細胞(補充圖A)。我們在顆粒細胞層沒有觀察到任何TUNEL陽性細胞(補充圖B

27、),但是,在同一個切片大腦皮層上有相當數量的TUNEL陽性細胞,相反,同樣作為陽性對照,抗酶前處理的腦切片顯示在海馬和大腦皮層上有大量的TUNEL陽性細胞(補充圖),我們進一步考察了HDG的FJB-陽性細胞和胞核的形態(tài),發(fā)現它們中大部分表現為細胞核輕微固縮但沒有明顯碎裂(圖5)。
　　 以上研究表明:繼發(fā)性細胞死亡主要發(fā)生在中度TBI后24h內。為進一步確定這一分布形式是發(fā)生在創(chuàng)傷性腦損傷后24h內或在24h后繼續(xù)保持一致?我們

28、研究了損傷3d后的細胞死亡及其分布,中度的可控性大腦皮層創(chuàng)傷性損傷后,海馬繼發(fā)性死亡主要發(fā)生在顆粒細胞層。假手術組和空白對照組未見明顯的死亡陽性細胞；TBI后海馬齒狀回內的細胞死亡發(fā)生非常迅速,超過80％齒狀回顆粒細胞層(GCL)的細胞死亡發(fā)生在中度。TBI后的24h內,齒狀回顆粒細胞層(GCL)神經元死亡的時域分布表明,防止神經細胞死亡最佳治療時間窗為損傷后4h,且不能遲于損傷后24h；不僅在TBI后的最初幾個小時,甚至在TBI后數天

29、當細胞死亡率減小后,未成熟的神經元對創(chuàng)傷性腦損傷的耐受性仍是高度脆弱的,在創(chuàng)傷性腦損傷7d后,顆粒細胞層死亡細胞中大多是未成熟顆粒神經元,只有一小部分是成熟的顆粒神經元；顆粒細胞層中沒有檢出細胞凋亡,顆粒細胞層不成熟神經元可能不是死于細胞凋亡。
　　 綜上所述:TBI后海馬實驗小鼠經一段時間(4h,24h,48h,3d,7d和14d),發(fā)現4h最多新生細胞死亡,繼發(fā)性細胞死亡主要發(fā)生在中度TBI后24h內,隨時間延長有不同程度的

30、新生和成熟細胞死亡。提示臨床病人可以爭取寶貴的搶救時間,有效地預防和控制海馬細胞死亡,保護其生理功能。
　　 創(chuàng)傷性腦損傷后,新生神經元是隨著時間的推移繼續(xù)死亡,還是在創(chuàng)傷性腦損傷后期,細胞死亡會從新生神經元死亡轉變?yōu)槌墒旒毎劳鲇写芯?。為?我們通過組合使用針對成熟神經元和不成熟神經元的不同抗體的FJB染色和免疫染色,對顆粒細胞層中受影響的神經元類型進行了進一步評估,創(chuàng)傷性腦損傷后用NeuN針對成熟的神經元,用NCAM針對未

31、成熟的神經元分別染色2周。按照NCAM/FJB與NeuN/FJB共存比計算,在損傷后的整個急性期(4h)和亞急性期(7d)未成熟神經元與成熟退化神經元恒定的較高比例表明,未成熟的神經元是對海馬內創(chuàng)傷性腦損傷耐受性差的主要神經元群。這些定量的結果證實了我們以前的研究結果,結果也表明不成熟的神經元值得作為一個可能的治療靶點予以重視。為什么不成熟的神經元對創(chuàng)傷性腦外傷的耐受性如此脆弱仍未知。最近有關齒狀回新生神經元的發(fā)育期間電生理特性的研究表

32、明,新生神經元在電生理上與齒狀回顆粒細胞成熟的不同。由于其獨特的離子通道表達,新生未成熟神經元比成熟神經元更容易被激活。分析這些電生理特征得出:這些新生神經元對由創(chuàng)傷性腦損傷后受損神經元釋放的神經遞質夸張興奮反應將是有意義的。
　　 分子生物學技術作為一項新技術為腦損傷研究注入活力,開辟了新的研究領域,但創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性神經細胞損害的分子生物學機制研究剛剛起步,尚未得出肯定結論。有關腦損傷的基因治療仍處于動物實驗研究階段,尚