Honokiol對創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 Honokiol改善大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討Honokiol是否對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能障礙具有改善作用；同時(shí)，明確Honokiol治療創(chuàng)傷性腦損傷的合適劑量，為其潛在的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組(每組10只)：假手術(shù)組（sham組），顱腦損傷組（TBI組），Honokiol0.5mg組，Honokiol1.0mg組，Honokiol2.0mg

2、組。sham組大鼠僅僅模擬假性顱腦損傷，其余各組采用TBI-0310顱腦損傷儀制作標(biāo)準(zhǔn)的CCI中度顱腦損傷模型；對于sham組和TBI組，在創(chuàng)傷后第一天的第8h和16h經(jīng)尾靜脈給予相同容量的Vehicle(供溶解Honokiol用)，之后每天一次在早晨8時(shí)給予相同容量的Vehicle，共計(jì)給藥5天，而各Honokiol組則按前述給藥方式給予相應(yīng)劑量的Honokiol。并在TBI后第1、3、7、14、21天采用mNSS評分法對各組大鼠腦創(chuàng)

3、傷后神經(jīng)功能缺失情況進(jìn)行評估Δ。
　　2.取30只SD大鼠隨機(jī)分為5組(每組6只)，分組和處理方式同上，但是，對于各劑量Honokiol組，僅在傷后的第一天的第8h和16h給藥兩次，各組大鼠在腦損傷后24h獲取腦組織，采用干濕重法測定腦組織含水量。
　　3.取30只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只)： sham組， TBI組， Honokiol1.0mg組（簡稱Honokiol組，根據(jù)量效關(guān)系確定的合適劑量），造模和給藥方案

4、同方法1。并分別于1、3、7、14、21天進(jìn)行Beam WalK Test試驗(yàn)，15、16、17、18、19天進(jìn)行Morris Water Maze（MWM水迷宮）試驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1. mNSS評分結(jié)果顯示，與Sham組比較，TBI造成明顯的神經(jīng)功能缺失。給予Honokiol治療后第一天，各劑量組不能減輕其神經(jīng)功能缺失程度。與TBI+Vehicle組比，Honokiol0.5mg組在3、7、14天能減輕神經(jīng)功能缺失，

5、Honokiol1.0mg組在3、7、14、21天均能減輕TBI大鼠的神經(jīng)功能缺失，而Honokiol2.0mg組在3、7、21天能減輕TBI大鼠的神經(jīng)功能缺失。各劑量組之間比較， Honokiol1.0mg組與Honokiol0.5mg組和Honokiol2.0mg比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示更好的神經(jīng)功能保護(hù)作用。
　　2.與 Sham組比較，TBI導(dǎo)致腦含水量明顯增加，而給予 Honokiol治療，各劑量組均能減輕腦含水量。

6、但是，Honokiol1.0mg組與Honokiol0.5mg組和Honokiol2.0mg組比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示更好的減輕腦水腫作用。
　　3. Beam WalK Test結(jié)果顯示，與Sham組比較，TBI造成明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙，而給予Honokiol治療，能明顯改善其運(yùn)動(dòng)功能障礙。與TBI+Vehicle組比較，Honokiol在3、7、14、21天能減輕TBI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙。Morris Water Maze試

7、驗(yàn)顯示，與 Sham組比較，在 Spatial learning測試中， TBI導(dǎo)致明顯的空間學(xué)習(xí)功能障礙，而給予Honokiol治療，能明顯改善其學(xué)習(xí)功能障礙。與TBI+Vehicle組比較，Honokiol在16、17、18天能減輕TBI大鼠的空間學(xué)習(xí)功能障礙；而在Probe trial測試中，TBI造成明顯的參考記憶功能障礙，與TBI+Vehicle組比，給予Honokiol治療，能明顯改善其記憶功能障礙。
　　結(jié)論：Hon

8、okiol能減輕 TBI后大鼠神經(jīng)功能缺失和腦水腫，而且,1.0mg/kg的 Honokiol為本次試驗(yàn)中合適的治療劑量，同時(shí)， Honokiol能改善TBI后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能障礙。
　　染色法對皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失情況進(jìn)行評估。
　　第二部分 Honokiol減輕大鼠顱腦創(chuàng)傷后的病理損害及抑制神經(jīng)元凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：觀察Honokiol對顱腦創(chuàng)傷后腦組織病理損害及神經(jīng)元變性凋亡的影響

9、，探討其對腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.取30只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只)： sham組， TBI組，Honokiol1.0mg組，sham組大鼠僅模擬假性顱腦損傷，其余各組采用TBI-0310顱腦損傷儀制作標(biāo)準(zhǔn)的CCI中度顱腦損傷模型。對于sham組和TBI組，在創(chuàng)傷后第一天的第8h和16h經(jīng)尾靜脈給予相同容量的Vehicl，之后每天一次在早晨8時(shí)給予相同容量的Vehicle，共計(jì)給藥5天。

10、而Honokiol組則按前述給藥方式給予相應(yīng)劑量的Honokiol。在傷后/假手術(shù)后第21天獲取腦組織標(biāo)本，采用H-E染色法對腦損傷體積進(jìn)行評估。
　　2.取30只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只)：分組和造模及給藥方案同前，在傷后/假手術(shù)后第21天獲取腦組織標(biāo)本，采用Nissl染色法對皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失情況進(jìn)行評估。
　　3.取24只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：分組和造模同前，但對于Honokio

11、l組，僅在傷后第一天的第8h和16h給藥兩次，在腦創(chuàng)傷/假手術(shù)后24h獲取腦組織標(biāo)本，采用FJ-B標(biāo)記法對皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性情況進(jìn)行評估。
　　4.取24只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：分組和造模同前，但對于Honokiol組，在傷后第一天的第8h和16h給藥兩次，隨后每日給藥一次，共計(jì)給藥3天，在傷后/假手術(shù)后第3天獲取腦組織標(biāo)本，采用NeuN+Tunel免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬CA1區(qū)神經(jīng)

12、元凋亡情況進(jìn)行評估。
　　結(jié)果：
　　1.與 TBI+Vehicle組（36.79±1.13 mm3）比較，大鼠 TBI給予Honokiol治療（21.37±1.01 mm3），能明顯減輕TBI造成的腦組織缺損（P＜0.05）；線性回歸分析提示，其減輕腦組織缺損與在Beam Walk Test測試中改善其運(yùn)動(dòng)功能具有高度相關(guān)性（r2=0.93;P＜0.0001）。
　　2. TBI造成大鼠皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍（62.84±4

13、.22 vs206.39±1.91 in sham組）和海馬CA1區(qū)（76.19±4.21 vs185.97±1.88 in sham組）明顯的神經(jīng)元缺失，與 TBI+Vehicle組比，大鼠 TBI后給予Honokiol治療，能明顯減輕TBI造成的皮質(zhì)（145.14±2.59）和海馬CA1區(qū)（136.76±2.53）神經(jīng)元丟失；線性回歸分析提示，其增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活與在Morris Water Maze實(shí)驗(yàn)中改善其學(xué)習(xí)功能具

14、有高度相關(guān)性（r2=0.94;P＜0.0001）。
　　3. TBI造成大鼠皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍（110.70±4.72）和海馬 CA1區(qū)（134.95±8.63）明顯的神經(jīng)元變性，與 TBI+Vehicle組比，大鼠 TBI后給予 Honokiol治療，能明顯減輕 TBI造成的皮質(zhì)（33.28±1.88）和海馬CA1區(qū)（59.74±6.50）神經(jīng)元變性（P＜0.05）。
　　4. TBI誘發(fā)大鼠皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍（37.13±1.9

15、4％）和海馬 CA1區(qū)（60.01±3.18%）明顯的神經(jīng)元凋亡，與TBI+Vehicle組比，大鼠 TBI后給予 Honokiol治療，能明顯減輕 TBI造成的皮質(zhì)（12.11±1.16%）和海馬CA1區(qū)（19.12±1.67%）神經(jīng)元凋亡。
　　結(jié)論：Honokiol能顯著減輕TBI后大鼠腦損傷體積,增加皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬神經(jīng)元存活數(shù)；Honokiol也能明顯減少皮質(zhì)創(chuàng)傷灶周圍和海馬神經(jīng)元的變性和凋亡；Honokiol對神經(jīng)

16、元的這種保護(hù)作用有利于改善顱腦損傷后大鼠的神經(jīng)功能障礙。
　　第三部分 Honokiol對大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期活化的影響
　　目的：觀察大鼠顱腦損傷后細(xì)胞周期的活化情況以及Honokiol對大鼠顱腦損傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期活化的影響，探討Honokiol抑制大鼠顱腦損傷后神經(jīng)元凋亡的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　1.對于每個(gè)待研究的細(xì)胞周期蛋白，取12只SD大鼠隨機(jī)分為2組(每組6只)：sham組和TBI組，s

17、ham組大鼠僅模擬假性顱腦損傷，TBI組造模同前，在第1、3、7、14、21天獲取腦組織標(biāo)本，采用Western-Blot法測定顱腦損傷/假手術(shù)后腦組織周期蛋白的表達(dá)情況。
　　2.對于每個(gè)待研究的細(xì)胞周期蛋白，取18只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組6只)： sham組，TBI+Vehicle組，Honokiol1.0mg組，造模和給藥方式第二部分，根據(jù)上述研究得出的細(xì)胞周期蛋白表達(dá)變化的峰值時(shí)間點(diǎn)決定給藥總時(shí)間，第一天為兩次（間隔時(shí)

18、間同前），之后為每日一次，最多給藥5天；在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)獲取腦組織標(biāo)本，采用Western-Blot法觀察Honokiol對細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。
　　3.取24只SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：分組和造模同前。對于Honokiol組，在傷后給藥3天（方式同前），在顱腦損傷/假手術(shù)后3天獲取腦組織標(biāo)本，采用免疫熒光雙標(biāo)法觀察Honokiol對腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和E2F1表達(dá)的影響及細(xì)胞周期蛋白與神經(jīng)元凋

19、亡關(guān)系的影響。
　　結(jié)果：
　　1.顱腦損傷后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1，CDK4，pRb(Ser780)和E2F1表達(dá)升高，而p27表達(dá)降低，Cyclin D1和 E2F1在第3天達(dá)峰值，pRb(Ser780)在第1天達(dá)峰值，CDK4在傷后進(jìn)行性升高直達(dá)21天，p27則在傷后第3天降到最低值，直到第21天仍未完全恢復(fù)。
　　2.顱腦損傷后給予Honokiol治療，能顯著降低腦損傷后細(xì)胞周期蛋白Cyclin D

20、1，CDK4，pRb(Ser780)和E2F1的活化程度，同時(shí)也能升高內(nèi)源性細(xì)胞周期抑制性蛋白p27的表達(dá)。
　　3.顱腦損傷后神經(jīng)元出現(xiàn)Cyclin D1和E2F1的表達(dá)升高，同時(shí)大部分表達(dá)這些細(xì)胞周期蛋白的神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，而這些異常改變在給予Honokiol治療后，被明顯抑制。
　　結(jié)論：顱腦損傷后出現(xiàn)細(xì)胞周期的異常激活與顱腦損傷后神經(jīng)元的凋亡及神經(jīng)功能障礙有關(guān)，而Honokiol治療能抑制大鼠顱腦損傷后神經(jīng)元細(xì)胞周期的