亞低溫對癲癇持續(xù)狀態(tài)腦損傷神經(jīng)保護機制的實驗研究.pdf

1、第一部分亞低溫對幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)海馬神經(jīng)元損傷的保護作用
　　目的:給幼鼠腹腔注射毛果云香堿誘發(fā)出SE,研究亞低溫對幼鼠海馬神經(jīng)元細胞的保護作用。
　　方法:選擇3周齡Wister雄性大鼠60只,隨機分成生理鹽水對照組、地西泮組和地西泮+亞低溫干預(yù)2h組,每組20只。具體分組如下:地西泮組:SE后給予腹腔注射地西泮5mg/kg;地西泮+亞低溫干預(yù)2h組:SE后給予地西泮的同時給予物理降溫干預(yù)將深部體溫控制在32-34℃之間,

2、并維持2h:生理鹽水對照組:腹腔注射生理鹽水。各組幼鼠SE開始后3h、6h、24h和72h這4個時間點設(shè)定4個亞組。HE染色檢測海馬CA1和CA3區(qū)上高倍視野中正常神經(jīng)元細胞和壞死神經(jīng)元數(shù)目,定量觀察海馬神經(jīng)元細胞壞死情況;TLJNEL法檢測海馬CA1和CA3區(qū)相似部位單位面積TUNEL陽性細胞,定量觀察海馬神經(jīng)元細胞凋亡情況
　　結(jié)果:1.海馬CA1和CA3區(qū)的病理改變(HE染色):生理鹽水對照組:CA1和CA3區(qū)有3-5層神經(jīng)

3、元細胞且排列緊密且清晰,細胞形態(tài)基本正常,各時間段CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)無明顯差別。地西泮組:CA1和CA3區(qū)出現(xiàn)明顯神經(jīng)元丟失。3h出現(xiàn)細胞壞死,6h和24h神經(jīng)元壞死更加明顯,72h正常神經(jīng)元數(shù)目減少,神經(jīng)元排列松散。海馬神經(jīng)元壞死程度為CA3區(qū)＞CA1區(qū)。地西泮+亞低溫干預(yù)2h組:CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元壞死明顯減少,6h和24h細胞空泡壞死不明顯,72h正常神經(jīng)元數(shù)目未見明顯減少,神經(jīng)元排列尚緊密。自6h起CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元壞死百

4、分比明顯減少,與地西泮組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。2.海馬CA1和CA3細胞凋亡的改變:生理鹽水對照組:海馬CA1和CA3區(qū)偶見個別細胞核呈棕黃色染色的TUNEL陽性細胞。地西泮組:海馬CA1和CA3區(qū)6h起TUNEL陽性細胞增多,72hTUNEL陽性細胞明顯增多,表現(xiàn)為染色質(zhì)聚集,圓形或不規(guī)則的凋亡小體,染色不均,可見核固縮。自6h起與NS組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。海馬神經(jīng)元凋亡程度為CA1區(qū)＞CA3區(qū)。地西

5、泮+亞低溫干預(yù)2h組:與地西泮組相比,CA1和CA3 TUNEL陽性細胞計數(shù)明顯減少,自24h起與地西泮組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。
　　1.結(jié)論:1.SE后3h起海馬神經(jīng)元細胞壞死明顯,細胞凋亡在SE后6h明顯,隨著時間的延長至72h,海馬神經(jīng)元細胞壞死和凋亡不斷增加。2.在SE后,亞低溫能夠明顯減少海馬神經(jīng)元細胞的壞死和凋亡。
　　第二部分亞低溫對幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)海馬NMDAR1和C-JUN表達的影響

6、　　目的:通過NMDAR1與C-JUN的表達變化,研究亞低溫在腦損傷病變中起保護作用的機制,為兒童驚厥性腦損傷臨床應(yīng)用亞低溫提供實驗依據(jù)。
　　方法:選擇3周齡Wister雄性大鼠60只,按第一部分分組方法分成3組并按SE后不同時間點分成4亞組。免疫組化檢測海馬CA1和CA3區(qū)NMDAR1與C-JUN蛋白表達水平;采用實時熒光定量PCR法檢測海馬NMDAR1和C-JUN基因表達水平。
　　結(jié)果:1.海馬NMDAR1的改變:生

7、理鹽水對照組海馬CA1和CA3區(qū)NMDAR1免疫陽性神經(jīng)元細胞主要分布于錐體細胞層,在錐體細胞的樹突也有表達,蛋白表達水平穩(wěn)定;地西泮組:海馬CA1和CA3區(qū)自6h起NMDAR1蛋白表達水平明顯升高,持續(xù)性升高并維持至72h,與生理鹽水對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05;地西泮+亞低溫干預(yù)2h組:海馬CA1和CA3區(qū)自24h起NMDAR1蛋白表達水平明顯降低,與地西泮組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。生理鹽水對照組NMDA

8、R1基因有穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平;地西泮組NMDAR1mRNA在3h表達形成高峰,6h起開始略有下降并維持高水平至72h:地西泮+亞低溫干預(yù)2h組NMDAR1mRNA在72h表達明顯下調(diào),與地西泮組相比,差異有顯著意義P＜0.05。2.海馬C-JUN的改變:生理鹽水對照組:海馬CA1和CA3區(qū)見個別呈棕黃色染色的C-JUN免疫陽性細胞,C-JUN蛋白主要在細胞核和細胞漿中表達;地西泮組:海馬CA1和CA3區(qū)6h起C-JUN陽性細胞有增多,表現(xiàn)為

9、著色加深或密集濃染,24h陽性細胞明顯增多,72hC-JUN陽性細胞較24h有較少。自6h起與NS組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05;地西泮+亞低溫干預(yù)2h組:海馬CA1和CA3區(qū)6h起C-JUN陽性細胞明顯增多,與地西泮組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。24h起C-JUN陽性細胞明顯減少,72h進一步減少,與地西泮組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。生理鹽水對照組海馬有C-JUN基因有穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平;地西泮組C-JUN

10、mRNA于3h上升,6h略有下降,24h又再次上升,72h略有下降并維持較高水平,形成雙高峰;地西泮+亞低溫干預(yù)2h組C-JUNmRNA3h顯著上升,6h開始下降,24h顯著下降,72h下降至更低水平,在這三個時間點(3h,24h和72h),與地西泮組相比,差異有顯著意義P＜0.05。
　　結(jié)論:NMDAR1和C-JUN共同參與SE后腦損傷形成,亞低溫干預(yù)后,NMDAR1mRNA和蛋白表達下調(diào),C-JUNmRNA和蛋白早期表達上調(diào)