白果內(nèi)酯對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是當(dāng)前全球第三大致死類(lèi)疾病，僅次于心血管疾病和癌癥，而在我國(guó)，腦卒中已成為最主要的致死因素，也是導(dǎo)致重度、慢性成人殘疾的主要原因，嚴(yán)重危害人類(lèi)的生命與健康。根據(jù)其臨床發(fā)病特點(diǎn)不同，可以將腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類(lèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)缺血性腦卒中患者約占所有卒中患者的70％，而我國(guó)缺血性腦卒中約占所有卒中病例的85％，死亡率高達(dá)50％，存活的缺血性腦卒中患者中約有3/4不同程度地喪失勞動(dòng)能力或遺留有癱瘓，失語(yǔ)等嚴(yán)重的

2、后遺癥。近年來(lái)人們致力于研究缺血性腦損傷急性期的神經(jīng)損傷性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并在動(dòng)物模型上已發(fā)現(xiàn)很多具有神經(jīng)保護(hù)作用的化合物，但轉(zhuǎn)化后的臨床療效均不太理想。因此，闡明缺血性腦損傷的確切病理機(jī)制，提出新的卒中后神經(jīng)保護(hù)策略，研發(fā)療效確切并能讓更多患者受益的治療藥物仍然是當(dāng)前腦卒中治療亟待解決的問(wèn)題。此外，由于各種條件限制，能夠在缺血性腦損傷“黃金3小時(shí)”內(nèi)接受治療的患者很少，多數(shù)患者在急性期接受保守治療，損傷后期主要依靠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)修復(fù)，通過(guò)促

3、進(jìn)機(jī)體內(nèi)在的修復(fù)能力盡可能恢復(fù)患者的意識(shí)、感覺(jué)、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能，并且這已經(jīng)成為卒中后護(hù)理和治療的關(guān)鍵所在。因此，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)卒中后期神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵機(jī)制和分子靶標(biāo)，研發(fā)理想的恢復(fù)期治療藥物也已經(jīng)成為腦卒中研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　細(xì)胞自噬與凋亡是目前卒中機(jī)制研究比較重要的熱門(mén)領(lǐng)域。缺血性腦損傷后腦組織主要因供血、供氧不足會(huì)發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞的壞死與凋亡。其中，缺血半影區(qū)腦組織主要發(fā)生細(xì)胞凋亡，一種受多基因嚴(yán)格控制的死亡方式。細(xì)胞自噬是機(jī)體內(nèi)在調(diào)整

4、穩(wěn)態(tài)的有效機(jī)制，缺血缺氧引起的細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊或者不折疊的蛋白、受損的細(xì)胞器均需要通過(guò)自噬途徑被運(yùn)送至溶酶體降解，不能夠及時(shí)被清除的病理因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。神經(jīng)細(xì)胞在缺血、缺氧情況下激活保護(hù)性細(xì)胞自噬減少凋亡相關(guān)蛋白向線(xiàn)粒體內(nèi)的聚集，通過(guò)減少細(xì)胞色素C或Caspase-3的活化從而抑制細(xì)胞凋亡。因此，研發(fā)可以靶向調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性自噬并抑制細(xì)胞凋亡的藥物，能夠在缺血性腦損傷早期減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，減輕神經(jīng)功能損傷。
　　銀杏是一

5、種有著較早文獻(xiàn)記載并具有重要藥用價(jià)值的天然植物，在我國(guó)作為藥用已有五千多年的歷史，長(zhǎng)期應(yīng)用于防治心血管疾病，抗老防衰，抗癌和提高自身免疫力等方面。研究表明，銀杏葉和銀杏果中含有多種藥用成分可用于多種疾病的防治，成分主要是銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M和白果內(nèi)酯(bilobalide，BB)。其中白果內(nèi)酯是從銀杏葉中提取出的唯一一種倍半萜內(nèi)酯，具有抗興奮性毒性、抑制氧化應(yīng)激損傷、抗炎以及抗血小板聚集等作用，主要以與其他銀杏葉提取物聯(lián)合制劑的形

6、式應(yīng)用于腦血管相關(guān)疾病的臨床治療。目前白果內(nèi)酯含量較高的制劑是用于腦部、周?chē)餮h(huán)障礙的銀杏葉提取物注射液金納多（白果內(nèi)酯含量約占標(biāo)準(zhǔn)提取物的2.9％）;另有金閣萊(@)銀杏內(nèi)酯注射液，其中白果內(nèi)酯含量高達(dá)48％，主要用于缺血性腦卒中恢復(fù)期腦梗死適應(yīng)癥的治療。然而，盡管臨床應(yīng)用表明含白果內(nèi)酯的混合制劑對(duì)腦卒中具有較好的療效，但其具體有效成分不明，白果內(nèi)酯單體對(duì)缺血性腦卒中急性期和恢復(fù)期的療效和確切機(jī)制也不清楚，因此也限制了其在缺血性腦

7、損傷及適應(yīng)癥治療中的應(yīng)用。本課題在前期研究發(fā)現(xiàn)含有白果內(nèi)酯的銀杏內(nèi)酯注射液能夠減輕缺血性腦卒中急性期損傷的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究白果內(nèi)酯對(duì)小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(transient MiddleCerebral Artery Occlusion，tMCAO)形成的局灶性缺血性腦損傷急性期和恢復(fù)期神經(jīng)損傷及其神經(jīng)功能恢復(fù)的治療作用，并闡明其相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分白果內(nèi)酯對(duì)缺血性腦損傷急性期神經(jīng)保護(hù)作用及其與自噬的相關(guān)性
　　目的:建

8、立小鼠缺血性腦損傷再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)模型，研究白果內(nèi)酯對(duì)急性期神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，及對(duì)神經(jīng)元自噬和凋亡的調(diào)節(jié)，為深入闡明白果內(nèi)酯的作用機(jī)制并拓展其臨床應(yīng)用積累學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。
　　方法:(1)參考Longa法制備小鼠tMCAO模型，于缺血1h、血流再灌注6h后分組給予金納多(10 mg/kg)，3.5 mg/kg，7 mg/kg和14 mg/kg白果內(nèi)酯(BB，i.p.，bid)治療。血流再灌注7

9、2h后神經(jīng)功能評(píng)分，處死取材TTC染色，腦含水量測(cè)定。(2)制備小鼠tMCAO模型，并選取最小有效劑量7 mg/kgBB于血流再灌注6h后給藥，再灌注72h后處死分別取組織腦片和缺血半影區(qū)腦組織，利用免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記缺血半影區(qū)NeuN+神經(jīng)元，免疫熒光測(cè)定自噬相關(guān)蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase3與神經(jīng)元的共標(biāo)情況，Western Blot法分別對(duì)缺血半影區(qū)組織LC3，p62，Beclin1，BcL-2，Bax

10、和Cleaved-Caspase3等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。(3)離體培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞株N2a經(jīng)離體氧糖剝奪模型（oxygen glucose deprivation，OGD）3h后，分別復(fù)糖復(fù)氧(Reoxygenation)0、3、6、12和24h，Western Blot法分別檢測(cè)胞內(nèi)LC3、p62、Beclin1、BcL-2、Bax和Cleaved Caspase-3等蛋白水平，觀察復(fù)糖復(fù)氧后不同時(shí)間點(diǎn)自噬和凋亡的水平，并選擇合適復(fù)糖復(fù)氧時(shí)間

11、。(4) N2a細(xì)胞OGD3h后，用含不同濃度BB(0.01、0.1、1、10、25和50μM)的完全培養(yǎng)基復(fù)糖復(fù)氧24h，MTT法評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響。(5)N2a細(xì)胞OGD3h后，用含有1μM BB的完全培養(yǎng)基復(fù)糖復(fù)氧24h，利用Western Blot法分別進(jìn)行自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。(6) N2a細(xì)胞OGD3h后，同時(shí)給予細(xì)胞含2.5 mM自噬抑制劑3MA和1

12、μM BB的完全培養(yǎng)基復(fù)糖復(fù)氧24h，利用流式細(xì)胞儀和Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:(1) BB(7，14 mg/kg)能夠減少小鼠腦梗死體積，降低神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量。(2)7 mg/kg BB能夠減少tMCAO模型后小鼠缺血半影區(qū)神經(jīng)元的丟失。(3)7 mg/kg BB能夠升高模型72h后小鼠缺血半影區(qū)腦組織LC3熒光表達(dá)并抑制Cleaved Caspase-3熒光表達(dá)，其中LC3與Cleaved Ca

13、spase-3熒光都與神經(jīng)元細(xì)胞有部分共標(biāo)。(4)7 mg/kg BB治療能夠降低小鼠缺血半影區(qū)腦組織凋亡相關(guān)蛋白Bax，Cleaved Caspase-3，自噬底物蛋白p-62蛋白的表達(dá)，并升高BcL-2、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)。(5) N2a細(xì)胞OGD/R后3h自噬水平較對(duì)照組升高，并隨著時(shí)間推移細(xì)胞自噬水平下降，而細(xì)胞凋亡水平上升。(6) WB結(jié)果顯示，BB促進(jìn)復(fù)糖復(fù)氧24h后N2a細(xì)胞BcL-2、LC3-Ⅱ和Be

14、clin-1的蛋白表達(dá)，并降低Bax，Cleaved-Caspase3，自噬底物蛋白p-62蛋白表達(dá)。(7)自噬抑制劑3MA能夠部分取消BB對(duì)Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的抑制作用;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示白果內(nèi)酯能夠減少處于早期凋亡和晚期凋亡及壞死的細(xì)胞數(shù)目，而3MA部分取消BB對(duì)N2a細(xì)胞凋亡的抑制作用。
　　結(jié)論:自噬參與白果內(nèi)酯對(duì)缺血性腦損傷急性期的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分白果內(nèi)酯對(duì)缺血性腦損傷恢

15、復(fù)期神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)及其機(jī)制
　　目的:研究BB對(duì)缺血性腦損傷恢復(fù)期神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)作用，闡明其對(duì)成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化等功能的影響與機(jī)制，為揭示其腦卒中恢復(fù)期用藥的促神經(jīng)修復(fù)功能提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:參考Longa法制備小鼠I/R損傷模型，缺血1h、血流再灌注24h后利用神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行模型篩選，將模型成功小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組（Vehicle組），白果內(nèi)酯3.5 mg/kg、7 mg/kg和14 mg/kg給藥組

16、(BB3.5 mg/kg，7 mg/kg，14 mg/kg，i.p.，bid)，給藥14天和42天分別進(jìn)行內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)實(shí)驗(yàn):(1)統(tǒng)計(jì)術(shù)后各組小鼠死亡率和體重，并分別于術(shù)后1、3、7、14、28和42天進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，3、7、14、28和42天進(jìn)行踏空測(cè)試，于術(shù)后14和28天進(jìn)行轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)棒測(cè)試，分別記錄小鼠足失誤次數(shù)、右轉(zhuǎn)率和從轉(zhuǎn)棒滑落時(shí)間，評(píng)價(jià)BB對(duì)I/R損傷恢復(fù)期小鼠神經(jīng)感知、運(yùn)動(dòng)功能的影響。(2)術(shù)后38-42天

17、對(duì)小鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，評(píng)價(jià)BB對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力的影響。(3)利用小動(dòng)物MRI-T2加權(quán)成像技術(shù)在術(shù)后24h、7d、14d和42d在體觀察模型及14 mg/kg BB治療組小鼠腦組織損傷情況。(4)術(shù)后12-13天給予小鼠腹腔注射BrdU(5-Bromo-2-deoxy Uridine，Sigma;50 mg/kg，連續(xù)給藥4次，給藥間隔為12h)標(biāo)記S期增殖細(xì)胞，術(shù)后14天用于研究干細(xì)胞增殖的小鼠灌注取腦，完成Brd

18、U免疫組化，評(píng)價(jià)干細(xì)胞增殖情況;用于研究干細(xì)胞分化的小鼠于術(shù)后42天灌注取腦，完成BrdU/NeuN免疫熒光，評(píng)價(jià)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化的情況;同時(shí)，為探討藥物對(duì)神經(jīng)再生調(diào)節(jié)的機(jī)制，離體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)成體神經(jīng)干細(xì)胞研究藥物對(duì)干細(xì)胞存活、增殖和分化的影響，并初步探討其作用機(jī)制。(5)離體培養(yǎng)成體神經(jīng)干細(xì)胞(Adult neural stem cells，ANSCs)，利用MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別觀察OGD/R和不同濃度BB（0.01、0.1、1、

19、10和50μM）給藥對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞活力和自我更新的影響。(6)利用BrdU免疫熒光標(biāo)記法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)BB對(duì)干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。(7)利用免疫熒光標(biāo)記法觀察OGD/R7天后神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元（Tuj-1）和星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)分化的比率以及不同濃度BB（0.1、1和10μM）對(duì)干細(xì)胞定向分化能力的影響。(8)檢測(cè)OGD/R24h后，Western Blot法檢測(cè)不同濃度BB(0.1，1和10μM)對(duì)細(xì)胞p-Akt，p-p

20、38和p-JNK水平的變化影響。(9)利用JNK激動(dòng)劑茴香霉素(Anisomycin，Anis)預(yù)處理干細(xì)胞24h后，OGD2h后復(fù)糖復(fù)氧給予BB和Anis干預(yù)7天，免疫熒光法觀察OGD/R7天后BB對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向Tuj-1神經(jīng)元分化的影響。
　　結(jié)果:(1) BB(7，14 mg/kg)治療小鼠長(zhǎng)期存活率高于I/R模型小鼠，并且BB可以緩解I/R損傷導(dǎo)致的小鼠體重降低。(2)與模型對(duì)照組小鼠相比，7和14 mg/kg BB治療組

21、小鼠神功功能顯著改善，轉(zhuǎn)角測(cè)試中右轉(zhuǎn)率降低，轉(zhuǎn)棒測(cè)試中棒上停留時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)，在踏空測(cè)試中踏空率顯著降低。(3) Morris水迷宮定位航行測(cè)試中，BB能夠降低小鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間，同時(shí)在空間探索測(cè)試中BB能夠增加小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)，增加小鼠在平臺(tái)象限穿越的時(shí)間及次數(shù)。(4) MRI觀察到術(shù)后24h模型小鼠損傷側(cè)腦組織存在大面積高亮度信號(hào)，7天后信號(hào)變?nèi)醪⒊霈F(xiàn)腦組織缺損，14天時(shí)組織缺損邊緣出現(xiàn)高密度信號(hào)，42天組織梗死導(dǎo)致的缺損體積相

22、對(duì)固定，而給予14 mg/kg BB治療能夠延遲腦組織缺損的出現(xiàn)并減少梗死導(dǎo)致的腦組織缺損。(5)7 mg/kg和14 mg/kg BB增加術(shù)后14天小鼠SVZ和SGZ神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目和分布范圍。(6)7 mg/kg和14 mg/kgBB增加術(shù)后42天小鼠SVZ和SGZ區(qū)BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)目。(7)0.1、1、10和50μM BB能夠增加OGD/R后ANSCs細(xì)胞活力且能夠增加生長(zhǎng)7天后神經(jīng)球直徑和個(gè)數(shù)。(8) BB增加OGD

23、/R后BrdU+的ANSCs數(shù)目，并且能夠增加處于S期的細(xì)胞數(shù)目。(9) BB促進(jìn)OGD/R7天后ANSCs向Tuj-1+神經(jīng)元的分化。(10) BB抑制OGD/R后ANSCs內(nèi)p38和JNK的磷酸化水平的升高，同時(shí)升高Akt的磷酸化水平。(11)10μM JNK激動(dòng)劑茴香霉素取消BB促進(jìn)ANSCs向神經(jīng)元分化的作用。
　　結(jié)論: BB促進(jìn)缺血性腦損傷恢復(fù)期神經(jīng)再生，增強(qiáng)神經(jīng)功能修復(fù)。綜上所述，本文工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于:

24、　　1.發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯在I/R模型小鼠急性期的抗凋亡作用與調(diào)節(jié)自噬相關(guān)
　　通過(guò)對(duì)I/R經(jīng)典動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，白果內(nèi)酯對(duì)缺血性腦損傷的急性期損傷包括神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、腦梗死和腦水腫均具有顯著改善作用，并且白果內(nèi)酯可以促進(jìn)神經(jīng)元自噬并抑制神經(jīng)元凋亡;同時(shí)，離體研究證實(shí)白果內(nèi)酯通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自噬并抑制神經(jīng)元凋亡。研究為揭示白果內(nèi)酯在缺血性腦損傷急性期的神經(jīng)保護(hù)作用提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為拓展其在缺血性腦損傷急性期的臨床應(yīng)用積累了重要學(xué)術(shù)基

25、礎(chǔ)。
　　2.發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)醅在小鼠缺血性腦損傷恢復(fù)期發(fā)揮促神經(jīng)再生作用
　　研究發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯能改善缺血性腦損傷恢復(fù)期神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，并且能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生。同時(shí)，離體實(shí)驗(yàn)確證白果內(nèi)酯能夠促進(jìn)成體神經(jīng)干細(xì)胞存活、自我更新、增殖和向神經(jīng)元的分化，并且其對(duì)分化的積極作用與其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞JNK MAPK通路的抑制作用相關(guān)。研究深化了對(duì)白果內(nèi)酯應(yīng)用于缺血性腦損傷臨床恢復(fù)期的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為推廣白果內(nèi)酯聯(lián)合制劑和單體制劑在防治缺血性腦