線粒體自噬的抗缺血性腦損傷作用及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、腦缺血是一種由于組織血流供應(yīng)不足所引起腦組織損傷的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。缺血腦組織中的糖氧水平快速下降，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷，并最終影響神經(jīng)功能。腦缺血嚴(yán)重危害著人類健康，目前尚無有效治療手段。腦缺血病理過程十分復(fù)雜，缺血啟動(dòng)了多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過程，其中包括細(xì)胞自噬。自噬是指一種通過溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)大分子，回收利用多余或異常蛋白、細(xì)胞器的細(xì)胞內(nèi)過程。自噬對(duì)于維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對(duì)應(yīng)激狀態(tài)非常重要，與多種人類疾病密切相關(guān)。近年的研究表明，細(xì)胞自噬可能也

2、參與了腦缺血損傷的病理過程，然而其作用還存在爭(zhēng)議:通過抑制自噬可以緩解局灶性腦缺血及神經(jīng)退行性損傷，而另一些研究也提出了自噬可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此，自噬在缺血性腦損傷中的作用仍有待明確。此外，通過自噬途徑降解細(xì)胞內(nèi)損傷或多余線粒體稱作線粒體自噬，腦缺血過程中伴隨大量線粒體損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，損傷線粒體的清除有助于細(xì)胞存活。線粒體自噬的功能異常與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān)，然而在腦缺血中是否存在線粒體自噬還不明確，闡明其調(diào)控機(jī)制

3、將為進(jìn)一步利用線粒體自噬干預(yù)缺血性腦損傷提供重要依據(jù)。
　　本課題旨在明確缺血性腦損傷過程中自噬的作用，重點(diǎn)探索該過程中線粒體自噬的發(fā)生及其對(duì)缺血腦損傷的貢獻(xiàn)，并闡明其調(diào)控機(jī)制。
　　第一部分
　　自噬通過清除損傷線粒體保護(hù)小鼠腦缺血復(fù)灌損傷
　　利用小鼠中動(dòng)脈栓塞(MCAO)后血流復(fù)灌模型模擬腦缺血及其復(fù)灌過程。我們發(fā)現(xiàn)自噬在短暫性腦缺血（transient MCAO，tMCAO）復(fù)灌中被激活，給予自噬抑制劑3

4、-MA能加重神經(jīng)損傷，而在持續(xù)性腦缺血(permanennt MCAO，pMCAO)損傷中如果手術(shù)前給予3-MA，發(fā)現(xiàn)抑制自噬能夠起到神經(jīng)保護(hù)作用保護(hù)持續(xù)性腦缺血，提示自噬在腦缺血復(fù)灌前后作用不同，本課題首次發(fā)現(xiàn)其在腦缺血復(fù)灌過程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在小鼠腦缺血復(fù)灌3h后的半暗帶區(qū)域，線粒體被自噬泡所包裹，并且復(fù)灌后線粒體標(biāo)記蛋白TOMM20及COX4I1水平下調(diào)。Real-time PCR結(jié)果表明線粒體DNA編碼

5、基因Atpase6下調(diào)，同樣提示腦缺血復(fù)灌后存在線粒體自噬的現(xiàn)象。3-MA可增加tMCAO所致Cyt C的釋放，提示自噬可能清除了損傷線粒體。通過線粒體分裂蛋白Drp1抑制劑mdivi-1抑制線粒體自噬，能加重小鼠腦缺血復(fù)灌損傷。進(jìn)一步敲減線粒體自噬的重要蛋白Parkin，亦能加重氧糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation，OGD)所致神經(jīng)元損傷。這些結(jié)果提示清除損傷線粒體可能是自噬在復(fù)灌過程中發(fā)揮保護(hù)作用的主要途徑

6、。
　　上述研究表明線粒體自噬發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用，進(jìn)一步提示促進(jìn)線粒體自噬可能是一種潛在的腦缺血治療新策略。腦缺血過程伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，后者被證明通過多條信號(hào)通路激活自噬。因此，本課題研究的第二部分旨在明確腦缺血復(fù)灌過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否可通過增強(qiáng)線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分
　　適度誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過選擇性促進(jìn)線粒體自噬發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用
　　小鼠MCAO復(fù)灌即刻側(cè)腦室給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑3μ

7、g tunicamycin(TM)和20 ng thapsigargin(TG)，可顯著減少24 h后腦梗死體積，緩解腦缺血引起的葡萄糖代謝降低并改善神經(jīng)行為學(xué)癥狀。此外，TM和TG在OGD處理的原代培養(yǎng)神經(jīng)元中同樣發(fā)揮保護(hù)作用，并能被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA逆轉(zhuǎn)。TM和TG可劑量依賴地抑制OGD所致線粒體依賴的細(xì)胞凋亡。有意思的是，TM及TG均能在不影響自噬流的情況下進(jìn)一步選擇性加強(qiáng)線粒體自噬，促進(jìn)缺血復(fù)灌后Parkin被招募至線粒

8、體上。為明確線粒體自噬介導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的上述保護(hù)作用，通過藥理學(xué)和基因沉默手段阻斷線粒體自噬(3-MA、Mdivi-1、ATG7 knockdown)，發(fā)現(xiàn)可顯著逆轉(zhuǎn)TM和TG的保護(hù)作用。進(jìn)一步對(duì)EIF2S1，ATF4，Parkin分別進(jìn)行基因沉默，均能抑制線粒體自噬，逆轉(zhuǎn)TM和TG的保護(hù)作用。利用Parkin敲除雜合子小鼠(Parkin+/-)發(fā)現(xiàn)，TM的保護(hù)作用同樣消失。以上結(jié)果表明，TM和TG可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路PERK/EI

9、F2S1/ATF4調(diào)控Parkin蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)其向線粒體轉(zhuǎn)位并選擇性上調(diào)線粒體自噬，最終通過清除損傷線粒體發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用。
　　線粒體自噬發(fā)生及調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)Parkin是腦缺血過程中重要的線粒體自噬調(diào)控因素。然而腦缺血中Parkin蛋白表達(dá)水平隨著復(fù)灌時(shí)間延長(zhǎng)而快速下降，而同時(shí)線粒體自噬仍舊維持在一個(gè)較高的水平，提示還有其它線粒體自噬的途徑存在。Nix是一種線粒體外膜蛋白，被認(rèn)為是一種重要的線粒

10、體自噬受體，其對(duì)于紅細(xì)胞發(fā)育過程中的線粒體自噬起到關(guān)鍵作用。本課題進(jìn)一步探討了Nix介導(dǎo)的線粒體自噬在腦缺血復(fù)灌中的保護(hù)作用。
　　第三部分
　　Nix通過非Parkin依賴途徑調(diào)控線粒體自噬保護(hù)缺血復(fù)灌腦損傷
　　為明確Nix是否參與腦缺血復(fù)灌過程中的線粒體自噬，我們利用Nix+/+，Nix+/-，Nix-/-三種小鼠進(jìn)行MCAO手術(shù)，于缺血后復(fù)灌6h后檢測(cè)缺血腦組織線粒體膜蛋白TOMM20和COX4I1水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)

11、果發(fā)現(xiàn)Nix敲除抑制缺血復(fù)灌引起的線粒體自噬，給予GFP-Nix腺相關(guān)病毒(GFP Nix AAVs)可以逆轉(zhuǎn)Nix敲除引起的線粒體自噬障礙，同時(shí)也逆轉(zhuǎn)了Nix敲除引起的腦梗死增加。提示Nix參與了腦缺血復(fù)灌后的線粒體自噬并發(fā)揮保護(hù)作用。為探討Nix介導(dǎo)的線粒體自噬在此過程中是否依賴于經(jīng)典的Parkin途徑，本課題在Parkin-/-小鼠腦內(nèi)給予GFP Nix AAVs，發(fā)現(xiàn)Nix高表達(dá)后仍能逆轉(zhuǎn)Parkin敲除引起的線粒體自噬障礙并同

12、樣抑制其腦梗死體積增加。利用野生型小鼠，Nix-/-小鼠，Parkin-/-小鼠，Nix和Parkin共同敲除的小鼠(Nix-/-& Parkin-/-，DKO)，我們發(fā)現(xiàn)相較于Nix-/-或Parkin-/-小鼠，DKO小鼠的線粒體自噬水平顯著降低，反映在線粒體膜蛋白TOMM20和COX4I1的下降，以及自噬標(biāo)志蛋白LC3在線粒體上的比例減少，上述結(jié)果均表明了Nix是通過Parkin非依賴途徑介導(dǎo)的腦缺血復(fù)灌過程中的線粒體自噬，提示N