Ca-A-K通道在缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬神經(jīng)元自噬發(fā)生中的作用.pdf

1、目的:通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)模型觀察海馬神經(jīng)元中的自噬現(xiàn)象及Ca-A/K通道亞基的改變,初步探討自噬抑制劑3-Methyladenine(3-甲基腺嘌呤,3-MA)及自噬激活劑Rapamycin(雷帕霉素)在HIBD后海馬神經(jīng)元自噬發(fā)生中對Ca-A/K通道亞基的作用及可能機(jī)制。
　　方法:采用7日齡SD(Sprague Dawley)新生大鼠,根據(jù)

2、改良Rice-Vannucci法建立HIBD模型。將新生大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺氧缺血組(HIBD組)、3-MA干預(yù)組(3-MA組)及雷帕霉素組(RAPA組)。選取HIBD后0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h七個時間點作為取材點:采用HE染色法從細(xì)胞水平了解HIBD后各組海馬組織損傷情況;通過RT-qPCR法測定HIBD后海馬神經(jīng)元自噬標(biāo)記分子(LC3、Beclin-1)及Ca-A/K通道亞基(G

3、luR1、GluR2)mRNA水平的變化,并通過Western Blot方法從蛋白水平進(jìn)一步檢測Ca-A/K通道亞基(GluR1、GluR2)濃度的改變;應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對HIBD后海馬組織LC3、GluR1及GluR2分子的表達(dá)在細(xì)胞水平進(jìn)行定位。
　　結(jié)果:
　　1. HE染色結(jié)果顯示,Sham組左側(cè)海馬神經(jīng)元呈錐形或圓形,細(xì)胞3~4層,致密有序,胞核居中且圓滿透明,僅見少量神經(jīng)元變性或凋亡;HIBD組海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)

4、構(gòu)不完整、排列紊亂,細(xì)胞腫脹、破裂,輪廓模糊、界限不清,細(xì)胞明顯丟失,海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞疏松細(xì)胞間距增大;3-MA組海馬神經(jīng)元損傷較HIBD組輕,而RAPA組損傷加重,神經(jīng)元凋亡、壞死及細(xì)胞缺失的范圍較HIBD組大。
　　2. RT-qPCR法顯示,與Sham組相比,HIBD組LC3、 Beclin-1及GluR1表達(dá)上升,6 h表達(dá)即開始增加,12 h增加較明顯,24 h達(dá)到高峰,持續(xù)至48 h仍明顯升高(P<0.05),而GluR

5、2則相反,呈下降趨勢;與HIBD組相比,3-MA組LC3、Beclin-1、GluR1表達(dá)減少,0 h、1 h未見明顯差異,24 h表達(dá)最低,48 h仍處于較低水平(P<0.05),GluR2的表達(dá)則增加;與HIBD組相比,RAPA組LC3、Beclin-1、GluR1的表達(dá)于24 h達(dá)高峰,48 h仍維持在較高水平(P<0.05),GluR2的表達(dá)降低。
　　3. Western blot發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,HIBD組Glu

6、R1表達(dá)增加,于6 h開始出現(xiàn)變化,24 h達(dá)到高峰,持續(xù)至48 h仍存在明顯升高(P<0.05);與Sham組比,HIBD組GluR2表達(dá)減少,在6 h的時候出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異,24 h最低,48 h仍維持在較低水平(P<0.05)。
　　4.免疫組織化學(xué)染色法顯示,各組左側(cè)海馬神經(jīng)元中均有LC3、GluR1及GluR2的表達(dá);LC3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì),而GluR1、GluR2的表達(dá)則主要在細(xì)胞膜;與Sham組相比,HIB

7、D組LC3、GluR1的表達(dá)水平處于較高水平,而GluR2的表達(dá)較低甚至不表達(dá);與HIBD相比,3-MA組海馬神經(jīng)元細(xì)胞LC3、GluR1的表達(dá)減少,GluR2的表達(dá)反而增加,而RAPA組結(jié)果正好相反。
　　結(jié)論:
　　1. HIBD后海馬神經(jīng)元急性期即出現(xiàn)細(xì)胞損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞水腫,核溶解及碎裂,細(xì)胞空泡化,部分細(xì)胞分界模糊,并且涉及凋亡、自噬及壞死三種形式。
　　2. HIBD后自噬標(biāo)記分子LC3、Beclin-1及