丹參素、芍藥苷對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的 制備新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型，觀察中藥丹參有效成分中藥單體丹參素、芍藥有效成分中藥單體芍藥苷對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。以期為臨床尋找新的有效治療新生兒缺氧缺血性病(HIE)的藥物提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。 方法 1結(jié)扎新生大鼠左頸總動(dòng)脈，放入缺氧裝置箱，吸入92％氮?dú)饧?％氧氣混合氣，制備新生大鼠HIBD模型。假手術(shù)組僅切開(kāi)頸部皮膚，分離左頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎動(dòng)脈及不吸入低氧

2、混合氣。 2 將7日齡新生大鼠隨機(jī)分成2組：①假手術(shù)組(Sham)；②缺氧缺血模型組(HIBD)。缺氧缺血后48h多聚甲醛心臟灌注，斷頭取腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋。HE染色觀察腦組織病理改變及脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 3 將7日齡新生大鼠隨機(jī)分成5組：①假手術(shù)組(Sham+Veh)，假手術(shù)后Oh腹腔注射等量生理鹽水；②缺氧缺血模型組(HIBD+Veh)，缺氧缺血后0、24h

3、腹腔注射等量生理鹽水；③丹參素15mg/Kg.d，治療組(HIBD+DSS 15mg·Kg<'-1>·d<'-1>)，缺氧缺血后0、24h腹腔注射丹參素15mg/Kg.d；④丹參素30 mg·Kg<'-1>·d<'-1>治療組(HIBD+DSS 30mg/Kg.d)，缺氧缺血后0、24h腹腔注射丹參素30mg/Kg.d；⑤丹參素60 mg/Kg.d治療組(HIBD9+DSS 60mg·Kg<'-1>·d<'-1>)，缺氧缺血后0、24h

4、腹腔注射丹參素60mg/Kg.dHIBD+Veh組與各丹參素治療組再分為3個(gè)時(shí)點(diǎn)，即再分為缺氧缺血后6h、24h、48h亞組，每亞組6只大鼠。 4 Sham+Veh組新生大鼠于假手術(shù)后6h，HIBDq+Veh及各HIBD+DSS組分別于缺氧缺血(HI)6h、24h、48h斷頭取腦。制備腦勻漿，比色法黃嘌呤氧化酶法測(cè)定鼠腦勻漿SOD活性，改良的硫代巴比妥酸法(TBA法)測(cè)定MDA濃度水平，比色法測(cè)定NOS、iNOS活性，硝酸還原酶

5、法測(cè)定NO濃度水平。 5 Sham+Yeh組新生大鼠于假手術(shù)后48h，HIBD+Veh及各HIBD+DSS組于缺氧缺血后48h多聚甲醛心臟灌注，斷頭取腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋。HE染色觀察腦組織病理改變及脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標(biāo)記法(TIJNEL)染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 6 應(yīng)用以上方法行芍藥苷實(shí)驗(yàn)，將7日齡新生大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham+Veh)、缺氧缺血模型組(HIBD+Veh)，芍藥苷5mg/Kg.d治

6、療組(HIBD+PF5mg/Kg.d)，芍藥苷10 mg/Kg.d治療組(HIBD+PF 10mg/Kg.d)，芍藥苷20 mg/Kg.d治療組(HIBD+PF 20mg/Kg.d)。芍藥昔劑為5mg/Kg、10mg/Kg、20mg/Kg，每天一次。 結(jié)果 1新生大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織的病理改變與腦細(xì)胞凋亡觀察 Sham組大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)組織無(wú)水腫、壞死，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)Tunel陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。與Sha

7、m組比較，HIBD組新生大鼠大腦皮層及海馬區(qū)組織水腫，細(xì)胞周圍間隙增寬，胞體腫脹變圓，變大，胞漿染色變淺；Tunel染色陽(yáng)性凋亡細(xì)胞較多。 2 結(jié)扎新生大鼠左頸總動(dòng)脈并在缺氧條件下腦組織生化指標(biāo)的改變 1．1 與Sham+Veh組比較，HIBD+Veh組新生大鼠經(jīng)缺氧缺血造模后6h、24h、48h，大腦組織中SOD活性降低，MDA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 1．2 與sham+Veh組比較，HI

8、BD+Veh組新生大鼠大腦中iNOS在缺氧缺血后6h時(shí)變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在缺氧缺血24h、48h時(shí)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 1．3 與Sham+’Veh組比較，HIBD+Veh組NOS及NO在缺氧缺血后6h、24h、48h均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2 丹參素對(duì)新生鼠缺氧缺血性腦損傷具有保護(hù)作用 2．1各劑量HIBD+DSS組新生大鼠在缺氧缺血造模后6h

9、、24h、48h，大腦組織中SOD活性較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)回升，MDA水平回降，且呈一定的劑量效應(yīng)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2．2各劑量HIBD+DSS組新生大鼠在缺氧缺血造模后6h時(shí)，大腦組織中iNOS較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在缺氧缺血24h、48h時(shí)，各劑量HIBD+DSS組新生大鼠大腦組織中iNOS較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)回降，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，

10、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2．3各劑量HIBD+DSS組新生大鼠在缺氧缺血造模后6h、24h、48h，大腦組織中NOS、NO較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)回降，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2．4與HIBD+Veh組比較，各劑量HIBD+DSS組新生大鼠病理?yè)p傷減輕，凋亡細(xì)胞減少，且呈一定的劑量效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3 芍藥苷對(duì)新生鼠缺氧缺血性腦損傷具有保護(hù)

11、作用 3．1 各劑量HIBD+PF組新生大鼠在缺氧缺血造模后6h、24h、48h，大腦組織中SOD活性較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)回升，MDA水平水平回降，且呈一定的劑量效應(yīng)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．2 各劑量HIBD+PF組新生大鼠在缺氧缺血造模后6h時(shí)，大腦組織中iNOS較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在缺氧缺血24h、48h，時(shí)各劑量HIBD+PF組新生大鼠

12、大腦組織中iNOS較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)回降，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．3 各劑量HIBD+PF組新生大鼠在缺氧缺血造模后6h、24h、48h，大腦組織中NOS、NO較HIBD+Veh組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)回降，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．4 各劑量HIBD+PF組新生大鼠與HIBD+Veh組比較病理?yè)p傷減輕，凋亡細(xì)胞減少，且呈一定的劑量效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義(P<0.05)。 結(jié)論 1缺氧缺血可導(dǎo)致新生大鼠以腦細(xì)胞凋亡為形態(tài)學(xué)特征的腦損傷。其可能機(jī)制為缺氧缺血導(dǎo)致新生大鼠缺氧缺血早期腦nNOS產(chǎn)生增多，缺氧缺血后期腦iNOS產(chǎn)生增多，兩者產(chǎn)生的過(guò)高的NO有促腦細(xì)胞凋亡，從而起損害腦的作用；另外新生大鼠缺氧缺血后氧自由基損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化可能也與腦細(xì)胞凋亡有關(guān)。 2 丹參素具有抑制腦細(xì)胞凋亡，從而起腦保護(hù)作用。其機(jī)制可能與其在缺氧缺血早期抑制nNOS產(chǎn)生，在缺氧缺血后期