枸櫞酸咖啡因?qū)π律笫笕毖跞毖阅X損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景和目的：
　　新生兒缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指各種圍生期高危因素引起腦組織不同程度缺氧、血流減少甚至中斷，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，是新生兒死亡及遺留腦性癱瘓、癲癇、智力障礙、行為缺陷等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因，因此HIBD的早期干預(yù)成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。枸櫞酸咖啡因（caffeine citrate，CC）屬于甲基黃嘌呤類(lèi)藥物，為非選擇性腺苷受體（adenosi

2、ne receptors，AR）拮抗劑，可透過(guò)血腦屏障，通過(guò)拮抗腺苷受體發(fā)揮生物學(xué)作用，臨床上廣泛用于治療早產(chǎn)兒呼吸暫停（Apnea of premature， AOP）。研究表明，咖啡因不僅可以防治支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD），而且可以降低早產(chǎn)兒后期腦癱及認(rèn)知障礙的發(fā)生率。枸櫞酸咖啡因系通過(guò)直接作用于腦組織起保護(hù)作用還是通過(guò)改善通氣間接發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的，具體機(jī)制目前尚不明確。本

3、實(shí)驗(yàn)采用7日齡新生Sprague-Dawley（SD）大鼠，結(jié)扎左頸總動(dòng)脈并缺氧制備HIBD動(dòng)物模型，治療組給予CC干預(yù)治療，從海馬神經(jīng)細(xì)胞增生與凋亡、腦白質(zhì)髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）表達(dá)及遠(yuǎn)期大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變，探討CC對(duì)新生大鼠腦組織的保護(hù)作用，并進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)CC對(duì)缺氧缺血后腦組織腺苷A1受體（Adenosine1 Receptors，A1R）mRNA和腺苷A2a受體（Adenosine<

4、br>　　2a Receptors，A2aR）mRNA表達(dá)的影響，探討CC對(duì)新生大鼠HIBD的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
　　材料與方法：
　　72只7日齡新生SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、HIBD組、CC組，每組24只。假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎不缺氧；HIBD動(dòng)物模型制備參照Rice法，HIBD組和CC組均結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，然后放于母鼠身旁恢復(fù)1 h，進(jìn)而置于37℃恒溫的容器中，通入80 mL/L氧氣和920 m L/

5、L氮?dú)獾幕旌蠚怏w2 h。CC干預(yù)組在缺氧缺血（Hypoxic-ischemic，HI）前、HI后0min、24h、48h、72h腹腔注射20mg/kg的CC，假手術(shù)組和HIBD組等時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積的生理鹽水。至12日齡時(shí)每組處死16只大鼠，余飼養(yǎng)至28日齡：（1）在12日齡處死前各組隨機(jī)選取8只新生大鼠，分別腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）標(biāo)記新生細(xì)胞，劑量為50mg/kg，1次/12

6、h，連續(xù)5次，最后一次腹腔注射BrdU4h后斷頭取腦，采用HE染色對(duì)各組大鼠腦組織HI側(cè)CA1區(qū)光鏡下行病理學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HI側(cè)腦組織海馬齒狀回顆粒下層BrdU、海馬CA1區(qū)活化半胱氨酸基天冬氨酸酶-3（Cleaved cysteine aspartic acid specific protease，活化 Caspase-3）、皮層下白質(zhì)MBP的表達(dá)水平，TUENL法檢測(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞；（2）至12日齡時(shí)，各組隨機(jī)選取

7、8只新生大鼠，采用Real Time PCR測(cè)定HI側(cè)腦組織A1R mRNA、A2aR mRNA的水平；（3）余大鼠至28日齡時(shí)采用Y迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.各組新生大鼠HI側(cè)腦組織海馬區(qū)病理學(xué)觀察
　　假手術(shù)組大鼠HI腦海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞層次清晰，形態(tài)正常；HI后腦組織出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)改變，HIBD組表現(xiàn)為細(xì)胞排列紊亂、邊界不清；CC干預(yù)組較HIBD組細(xì)胞層次相對(duì)清晰，排列整齊。

8、
　　2.各組新生大鼠 HI側(cè)腦組織海馬齒狀回BrdU、海馬CA1區(qū)活化Caspase-3及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞、皮層下白質(zhì)MBP的表達(dá)情況
　　HIBD組、CC組、假手術(shù)組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為56.50±0.91、59.10±0.54、41.25±1.27，前兩組均高于假手術(shù)組（ P<0.05），而前兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；各組活化 Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)高低依次為HIBD組、CC組、假手術(shù)組，分別

9、為：52.38±1.60、25.88±0.64、14.00±0.27，三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；假手術(shù)組海馬CA1區(qū)可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（9.13±0.35），HIBD組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（37.38±0.94）最多，CC組（14.75±0.56）較HIBD組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，三組間兩兩相比有差異（P<0.05）；HIBD組較假手術(shù)組皮層下白質(zhì)MBP（用IOD值表示）明顯減少（P<0.05），給予CC干預(yù)后，MBP

10、表達(dá)水平較HIBD組升高（P<0.05）。
　　3.各組大鼠HI側(cè)腦組織A1R mRNA、A2aR mRNA的表達(dá)
　　HI后A1R mRNA較假手術(shù)組顯著上調(diào)（1.28±0.34 vs1.02±0.18）（P<0.05），而A2aR mRNA變化不明顯（1.13±0.36 vs1.09±0.21）（P>0.05），給予CC干預(yù)后A1R mRNA較HIBD組下降（0.94±0.17 vs1.28±0.34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

11、（P<0.05），而A2aR mRNA下降不明顯（0.96±0.14 vs1.13±0.36）（P>0.05）。
　　4.各組大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的比較
　　28日齡時(shí)，Y迷宮測(cè)試顯示大鼠學(xué)會(huì)逃避電擊次數(shù)由低到高依次為假手術(shù)組（31.25±1.41）、CC組（39.75±2.51）、HIBD組（58.50±3.14），三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；記憶保持能力高低依次為 CC組（85.00±3.27）、假手