不同劑量托吡酯對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷腦保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:缺氧缺血性腦病（HIE）是新生兒期常見(jiàn)的疾病，是導(dǎo)致新生兒死亡和遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的重要因素。由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，對(duì)其損傷后的治療仍無(wú)有力措施。探討發(fā)病機(jī)制并在其關(guān)鍵分子上進(jìn)行有效干預(yù)，對(duì)于改善HIE預(yù)后，提高人口質(zhì)量具有重要意義。 托吡酯（TPM），是一種高效新型抗癲癇藥，大量實(shí)驗(yàn)表明其在腦損傷后腦保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究表明托吡酯在保護(hù)缺氧缺血性腦損傷（HIBD）發(fā)揮著重要的作用，未來(lái)有可能用于臨

2、床治療HIBD。但是關(guān)于托吡酯腦保護(hù)作用的具體機(jī)制、給藥劑量及藥物副作用等目前研究較少。 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）是TGF-β超家族的一個(gè)新亞族成員，發(fā)揮著多效能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，并且在改善和促進(jìn)損傷后的神經(jīng)元修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要作用。腦缺氧缺血可能是腦內(nèi)GDNF分泌增加的啟動(dòng)因素之一，本課題組前期通過(guò)對(duì)7日齡的Wistar大鼠研究發(fā)現(xiàn)，HIBD假手術(shù)組偶見(jiàn)GDNF表達(dá)；單純?nèi)毖跞毖MGDNF于缺氧缺血后12h開(kāi)始上

3、升，第2d進(jìn)一步升高，第3d達(dá)高峰，第5d有所回落。 有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞除了表達(dá)Na+和Ca2+通道以外，GluR及GABAR在其細(xì)胞膜表明亦有表達(dá)，鑒于托吡酯具有抑制Na+或/和Ca2+通道激活以及調(diào)節(jié)腦內(nèi)GluR及GABA平衡之功效。因此，推測(cè)托吡酯有可能通過(guò)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的相應(yīng)受體，達(dá)到保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)GDNF的分泌，進(jìn)而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。本課題組的前期研究已證實(shí)這一點(diǎn)，研究顯示：不同時(shí)間托吡酯給藥

4、后觀察組GDNF的分泌量具有差異性。 本課題組前期研究已證明托吡酯用于HIBD的治療時(shí)間窗較短，為缺氧缺血后2h之內(nèi)，且預(yù)防用藥優(yōu)于損傷后用藥；托吡酯的腦保護(hù)作用與GDNF的分泌增加有直接關(guān)系。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示托吡酯對(duì)腦缺血有明顯的治療作用，劑量多在50mg/kg-200mg/kg之間，并未產(chǎn)生損傷邊緣系統(tǒng)及影響骨骼發(fā)育等副作用。本課題通過(guò)建立HIBD動(dòng)物模型，借助觀察腦損傷后給予不同劑量托吡酯對(duì)腦組織病理學(xué)改變、GDNF動(dòng)

5、態(tài)表達(dá)水平等方面的影響，進(jìn)一步探討托吡酯腦保護(hù)作用的機(jī)制、用藥劑量，為托吡酯臨床治療HIE提供強(qiáng)有力的理論和試驗(yàn)依據(jù)，為HIE的治療開(kāi)辟一條新的道路。 目的: 1.觀察新生大鼠各處理組相同時(shí)間點(diǎn)腦組織的病理學(xué)改變. 2.觀察新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后GDNF表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化及不同劑量托吡酯干預(yù)對(duì)GDNF表達(dá)的影響。 3.探討托吡酯腦保護(hù)作用的機(jī)制。 方法: 1.120只新生7日齡Wist

6、ar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖跞毖M及托吡酯治療組，托吡酯治療組根據(jù)不同給藥劑量分為50mg/kg、100mg/kg及150mg/kg治療組. 2.建立HIBD動(dòng)物模型. 3.給藥及處理方法 （1）托吡酯治療組：將托吡酯溶于注射用水配成2％溶液，采用小型灌胃器灌胃。不同劑量托吡酯治療組分別于手術(shù)前30min給予1次、HIBD模型建成后即刻給予1次、之后每隔12h各一次，直至第5d。 （2）單純?nèi)毖跞毖M和

7、假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)給予等體積的生理鹽水。 （3）各組均在缺氧缺血后12h、2d、3d、5d分別處死1/4的動(dòng)物。 4.應(yīng)用HE染色、免疫組織化學(xué)（Immunocytochemistry）及Western Blotting等試驗(yàn)方法。觀察和測(cè)定研究指標(biāo)。 結(jié)果: 1.HE染色結(jié)果假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)層次清晰，細(xì)胞輪廓清楚，核居中，尼氏體位于核周邊；單純?nèi)毖跞毖M在缺氧缺血后12h缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體出現(xiàn)輕微的病理

8、變化，第2d病變最嚴(yán)重，表現(xiàn)為皮質(zhì)、紋狀體、海馬、丘腦大片壞死區(qū)，第3d病變減輕，出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，第5d基本上未見(jiàn)破裂細(xì)胞，出現(xiàn)大片膠質(zhì)瘢痕；50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組術(shù)后12h上述部位病變不明顯，第2d出現(xiàn)輕微病變，表現(xiàn)為極少數(shù)細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞核濃縮，第3d、5d未見(jiàn)明顯病灶；其中150mg/kg托吡酯治療組腦損傷減輕程度較100mg/kg托吡酯治療組明顯，而100mg/kg托吡酯治療組又優(yōu)于5

9、0mg/kg托吡酯治療組，50mg/kg托吡酯治療組較單純?nèi)毖跞毖M腦損傷程度減輕。 2.免疫組織化學(xué)假手術(shù)組僅見(jiàn)較少的GDNF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，著色較淺，稀疏地分布于整個(gè)大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬，雙側(cè)對(duì)稱(chēng)，各時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)未見(jiàn)明顯的動(dòng)態(tài)變化；單純?nèi)毖跞毖M和托吡酯各治療組非缺血側(cè)GDNF陽(yáng)性細(xì)胞染色的程度、數(shù)量及變化情況均類(lèi)似于假手術(shù)組；單純?nèi)毖跞毖M缺血側(cè)皮質(zhì)GDNF陽(yáng)性細(xì)胞在損傷后12h開(kāi)始表達(dá)，第2d進(jìn)一步上升，第3d達(dá)高峰，第

10、5d基本恢復(fù)正常，僅見(jiàn)極少量的GDNF表達(dá)；50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組缺血側(cè)皮質(zhì)在損傷后12h即可見(jiàn)較多GDNF表達(dá)，第2d進(jìn)一步增加，第3d達(dá)高峰，第5d有所減少，但還可見(jiàn)較多的表達(dá)，且150mg/kg托吡酯治療組GDNF的表達(dá)尤為明顯，托吡酯治療組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上GDNF的表達(dá)均明顯高于單純?nèi)毖跞毖M。GDNF的表達(dá)增加與托吡酯成劑量正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.Western blottin

11、g單純?nèi)毖跞毖M與托吡酯各處理組均有GDNF蛋白表達(dá)條帶，150mg/kg托吡酯治療組蛋白表達(dá)明顯高于單純?nèi)毖跞毖M，100mg/kg托吡酯治療組稍弱，50mg/kg托吡酯治療組較差。應(yīng)用生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（Alphaimager2200）掃描定量，通過(guò)計(jì)算出各組蛋白表達(dá)的相對(duì)積分值作出蛋白的相對(duì)含量，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)：50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治療組各時(shí)間點(diǎn)上蛋白表達(dá)均高于單純?nèi)毖跞毖M，有統(tǒng)計(jì)學(xué)