不同療程高壓氧治療對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、已有不少實驗研究結(jié)果提示HBO治療新生大鼠HIBD的有效時間窗為6～12 h。然而，臨床上HBO治療新生兒HIE一般要在生后1周左右開始，治療2～3個療程。有不少報道用這種方法治療是有效療的。為何HBO治療的時間窗在實驗研究與臨床實踐之間有較大的差異呢？其原因尚不清楚。為此我們提出假設(shè)，增加HBO的療程可以延長其治療的時間窗。那么，增加HBO的治療時間或療程后是否能夠增強NSCs的增殖和分化呢？目前國內(nèi)外的研究都只給1個療程(5～7次)

2、，甚至1次的HBO治療，尚未見到多療程HBO對HIBD新生大鼠影響的文獻(xiàn)報道。如果能夠通過實驗證實多療程HBO能夠延長治療的時間窗，并提高療效的話，這將為臨床 本研究分為三部分： 第一部分實驗觀察在常規(guī)的治療時間窗(HIBD后2h)開始多個療程的HBO治療對HIBD新生大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的影響。研究結(jié)果顯示了在HIBD后2h給予1個療程的HBO治療即能夠使神經(jīng)元凋亡減少至接近正常，因此，即使再增加療程也不再顯示對神經(jīng)元凋

3、亡的抑制作用了。但是對HIBD新生大鼠行為學(xué)的改善卻隨著療程的增加而增加。這一結(jié)果提示增加HBO的療程可增強對行為學(xué)損害的保護作用，而這種保護作用的機制除了減少神經(jīng)元凋亡以外，可能還存在著其它原因。根據(jù)我們最近的實驗發(fā)現(xiàn)HBO治療可促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖與分化[余小河，2004;王曉莉，2007；Yang YJ，2008]，為此我們提出假設(shè)，增加HBO療程能夠增強對行為學(xué)損害的保護作用的機制與增強了促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增

4、殖與分化的作用有關(guān)。在這基礎(chǔ)上設(shè)計了第二部分實驗。 第二部分實驗觀察了在常規(guī)的治療時間窗(HIBD后2h)開始多個療程的HBO治療對HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖與分化。實驗結(jié)果證實了增加HBO療程確實可增強HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖，并分化為神經(jīng)元。有了這一結(jié)果，進(jìn)一步我們就可以開始探討延長HBO治療時間窗后，是否可通過增加療程來提高療效。 第三部分實驗主要探討在HIBD后48 h和96 h開始不同療程

5、的HBO治療對HIBD新生大鼠有否保護作用。結(jié)果是肯定的，證明了即使是長達(dá)96 h的時間窗開始HBO治療，通過增加療程也可獲得明顯的保護作用。 各部分的具體內(nèi)容如下。 一、不同療程HBO對HIBD新生大鼠行為學(xué)及組織學(xué)的影響 目的:通過觀察多療程HBO治療對HIBD新生大鼠腦部病變和遠(yuǎn)期行為學(xué)的影響，探討增加HBO的療程是否能夠提高其療效。 方法:7日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為5組

6、：1)正常對照組(CON，n=10)，2)缺氧缺血腦損傷組(HIBD，n=10)，3)高壓氧1療程組(HBO-1，n=10)，4)高壓氧2療程組(HB0-2，n=10)，5)高壓氧3療程組(HB0-3，n=10)。HIBD組按照Rice-Vannucci方法制作新生大鼠HIBD模型。高壓氧治療組在HIBD模型制成后2小時開始治療，艙內(nèi)壓力2 ATA，穩(wěn)壓60 min，每日1次，7次為1個療程。休息3天再進(jìn)行下一個療程。療程結(jié)束后，各組均

7、等到鼠齡35天時進(jìn)行T迷宮試驗、放射臂迷宮試驗、足錯誤等行為學(xué)測試。測試完成后(鼠齡46天)處死動物，10％水合氯醛麻醉后打開胸腔，于心尖部插管注入生理鹽水，待流出液清亮后，再注入4％多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，取出左側(cè)大腦半球用4％多聚甲醛固定24h后石蠟包埋、固定、脫水后，切片機在前囟前1.0至-0.8mm冠狀位連續(xù)切片，片厚4μm，行TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡和尼氏染色觀察腦組織病理改變。 結(jié)果:(1) HBO組行為學(xué)測

8、試結(jié)果優(yōu)于HIBD組；(2)T迷宮測試中，隨著天數(shù)的增加，正常組和HBO組的正確率逐漸增高；而且隨著HBO療程的增加，正確率逐漸增加，訓(xùn)練至第3天時，HB0-3組正確率明顯高于HBO-1(P<0.05)。(3)放射臂迷宮測試中，隨著HBO療程的增加，覓水時間逐漸減少，HB0-3組所需時間明顯少于HBO-1和HB0-2組(P<0.01)；隨著HBO療程的增加，平均錯誤次數(shù)和重復(fù)次數(shù)逐漸減少，其中HB0-3組重復(fù)次數(shù)明顯低于HBO-1和HB

9、0-2組(P<0.01)。(4)足錯誤測試中，HIBD組右左差值較對照組、HB0-2、HB0-3組高(P<0.05)，隨著HBO療程的增加，足錯誤次數(shù)減少。(4)TUNEL染色顯示HBO治療可抑制HIBD新生大鼠皮層神經(jīng)元凋亡，但各療程組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(5)尼氏染色顯示HBO治療可使皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失較HIBD組顯著減少，但各療程組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論:(1)在短時間窗(2h)開始HBO治療，對HIBD

10、新生大鼠行為學(xué)損害的保護作用隨著療程增加而增加。(2)在短時間窗(2h)開始一個療程HBO治療，已經(jīng)能夠明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，增加療程不再加強這一作用。 二、不同療程HBO對HIBD新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的影響 目的:第一部分的研究結(jié)果顯示了在HIBD后2h給予1個療程的HBO治療即能夠明顯抑制神經(jīng)元凋亡，再增加療程已無法顯示抗凋亡作用的繼續(xù)增強。但是隨著療程的增加，HBO對HIBD新生大鼠遠(yuǎn)期行為學(xué)的改善更為明

11、顯。為此我們推測是否增加HBO的療程可通過刺激內(nèi)源性NSCs的增殖和分化來加強對行為學(xué)損傷的保護作用的。因此，本研究通過觀察增加HBO療程是否能夠增強刺激HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖和分化。 方法:7日齡SD大鼠隨機分為5組：1)正常對照組(CON，n=20)，2)缺氧缺血腦損傷組(HIBD，n=20)，3)高壓氧1療程組(HBO-1，n=20)，4)高壓氧2療程組(HB0-2，n=20)，5)高壓氧3療程組( HB0-

12、3，n=20)。HIBD模型制作與HBO治療方法同第一部分。每組各取10只動物在第三個療程完成前48小時(即鼠齡33天時)腹腔注射BrdU(每次50 mg/kg，每8小時注射1次，連續(xù)5次)。各組動物均等到鼠齡35天時處死(方法同第一部分)取腦組織切片，采用BrdU/Nestin免疫熒光雙標(biāo)法檢測缺血側(cè)側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ區(qū))和海馬齒狀回(DG區(qū))的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的變化；免疫熒光雙標(biāo)法檢測大腦皮層BrdU/NSE和BrdU/GFA

13、P陽性細(xì)胞數(shù)量。同時每組另外的10只動物用10％水合氯醛麻醉后斷頭處死，取缺血側(cè)大腦半球全層腦組織約lOOmg，采用Western blot法檢測缺血側(cè)大腦半球nestin總蛋白的變化。 結(jié)論: HIBD后2小時給予HBO治療，通過增加HBO療程可促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖，并分化為神經(jīng)元。 三、增加HBO療程對延遲治療時間窗的新生大鼠HIBD療效觀察 目的:已有不少實驗研究結(jié)果提示HBO治療新生大

14、鼠HIBD的有效時間窗為6～12 h。然而，臨床上HBO治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy. HIE)一般要在生后1周左右開始，治療2～3個療程。有不少報道用這種方法治療是有效療的。為何HBO治療的時間窗在實驗研究與臨床實踐之間有較大的差異原因不清楚。根據(jù)我們前面的研究結(jié)果，在HIBD后2小時開始給予一個療程的HBO即可有效地抑制神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，對神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用。那么在時間窗廷

15、遲時，增加HBO療程是否也能夠?qū)p傷的神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用呢？為此我們提出假設(shè)，增加HBO的療程可以延長其治療的時間窗。本研究旨在探討多療程的HBO治療是否對96 h的時間窗的HIBD新生大鼠有保護作用。增加HBO療程能夠更好地減輕HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 方法:7日齡SD大鼠(88只)，隨機分為11個組(n=8)，包括正常對照組(CON)、缺氧缺血腦損傷組(HIBD)和高壓氧組(HBO)；HBO組根據(jù)HBO不同時間窗分為

16、2h高壓氧組(2H，在HIBD后2h開始給予HBO)、48h高壓氧組(48H，HIBD后48h給予HBO)及96h高壓氧組(96H，HIBD后96h給予HBO)等三個亞組；各亞組又根據(jù)不同療程分成一療程組( HBO-1)、二療程(HB0-2)和三療程組(HB0-3)等組。各組在HBO療程完成后置于空氣中喂養(yǎng)，待96H的三療程組完成全部療程后，即鼠齡38天(HIBD后31天)時一同處死，采用TUNEL染色檢測各組大腦皮層和海馬CA1區(qū)凋亡

17、；并采用NSE免疫組化方法檢測各組皮層神經(jīng)元數(shù)量。 結(jié)論:(1) HIBD后2小時給予一療程的HBO治療即可明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及保護神經(jīng)元；(2)隨著HBO開始治療的時間窗的延遲，一個療程的HBO對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用逐漸減弱，但通過增加療程可增強對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制與對神經(jīng)元的保護作用。 綜上所述，本研究結(jié)論如下： 1、HIBD后2小時給予HBO可對HIBD新生大鼠的遠(yuǎn)期腦功能有修復(fù)作用。而且隨著HBO療