MLK3的SUMO化在缺血性腦損傷中的作用及其分子機制的研究.pdf

1、目的：絲裂原蛋白激酶(MAPK)的上游激酶(MLK3)是絲蘇氨酸蛋白激酶，作為活化的絲裂原蛋白激酶(MAPK)的上游激酶激活JNKs信號通路。我室前期研究表明在全腦缺血再灌注條件下，MLK3激活JNKs信號通路，引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，但是引起神經(jīng)元凋亡的機理以及調(diào)節(jié)機制目前沒有闡明，SUMO化是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的類泛素化修飾，在細胞存活、凋亡及信號轉(zhuǎn)導中起到重要作用。因此我們提出MLK3的類泛素化(SUMOylation)參與神

2、經(jīng)元凋亡的設(shè)想，本課題擬研究在全腦缺血再灌注條件下MLK3發(fā)生SUMO化，以及MLK3SUMO化對MLK3的活性及其穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：采用SD大鼠四動脈結(jié)扎構(gòu)建全腦缺血模型研究MLK3的SUMO化修飾及其變化規(guī)律；SD大鼠連續(xù)3天側(cè)腦室注射PSD-95反義寡核苷酸研究PSD-95對MLK3 SUMO化調(diào)節(jié)作用；采用體外細胞培養(yǎng)研究MLK3 SUMO化的功能；采用免疫印跡方法檢測蛋白質(zhì)的表達水平；應用免疫共沉淀方法檢測蛋

3、白質(zhì)之間的相互作用。
　　結(jié)果：1.免疫印跡結(jié)果顯示在加入N-乙基馬來酰亞胺(NEM)的樣品中MLK3呈現(xiàn)兩條條帶，其中一條位于MLK3條帶上方，大約遷移10KD左右，而用SUMO1免疫沉淀，MLK3免疫印跡僅有一條條帶，結(jié)果表明MLK3能夠發(fā)生SUMO化(SUMO1)。2.大鼠全腦缺血15分鐘再灌注不同時間，MLK3的SUMO化不斷增高，在再灌注6小時可以達到對照組的2倍。3.缺血前連續(xù)3天側(cè)腦室注射突觸后密集區(qū)蛋白95(PSD

4、-95)反義寡核苷酸，降低MLK3的SUMO化水平，這就表明PSD-95能夠調(diào)節(jié)MLK3的SUMO化。4.在COS7細胞中分別表達野生型MLK3以及突變體MLK3(K401R)，其突變體MLK3的SUMO化水平明顯降低，表明MLK3的401位賴氨酸為主要的SUMO位點。5.在COS7細胞中分別表達野生型MLK3及突變體，以放線菌酮(CHX)抑制基因表達，MLK3(K401R)穩(wěn)定性明顯降低，結(jié)果表明MLK3的SUMO化能增加MLK3的穩(wěn)

5、定性。6.共表達海人藻酸受體亞基和野生型MLK3或其突變體，海人藻酸處理不同時間，野生型MLK3活性不斷升高而MLK3(K401R)活性則無明顯變化，結(jié)果表明MLK3 SUMO化能促進MLK3活化。
　　結(jié)論：1.全腦缺血再灌注促進海馬CA1區(qū)MLK3 SUMO化水平升高。2。PSD-95能調(diào)節(jié)MLK3 SUMO化。3.MLK3 SUMO化修飾位點為第401位賴氨酸。4.MLK3 SUMO化增強MLK3蛋白穩(wěn)定性。5.MLK3 S