Atg7在腦微血管生成和缺血性腦損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　血管生成是指在現(xiàn)有的血管基礎(chǔ)上形成新的毛細(xì)血管并不斷重塑的過(guò)程。正常的腦血管結(jié)構(gòu)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及功能的維持具有重要意義。研究表明，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均存在腦血管生成異常，而腦血管結(jié)構(gòu)和功能的異常對(duì)這些疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療均產(chǎn)生重要影響。因此，探討調(diào)節(jié)腦血管生成的機(jī)制就顯得尤為重要。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一個(gè)依賴于溶酶體的重要的降解途徑，參與調(diào)解內(nèi)皮細(xì)胞包括血管生成在內(nèi)的的多種功能。本文則通過(guò)體內(nèi)外抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)

2、胞中自噬相關(guān)基因Atg7的表達(dá)來(lái)探討自噬在腦血管生成中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　中風(fēng)是世界范圍內(nèi)成人第二大致死和致殘性疾病，可由多種原因引起，其中以缺血性中風(fēng)為最主要的中風(fēng)形式。缺血性中風(fēng)的病理過(guò)程非常復(fù)雜，氧氣和葡萄糖的缺乏導(dǎo)致一系列通路的激活。有證據(jù)表明，炎癥和免疫系統(tǒng)參與了急性腦缺血的全部過(guò)程，抑制腦內(nèi)炎癥水平會(huì)減少中風(fēng)導(dǎo)致的腦梗死體積和神經(jīng)損害，從而有效減少缺血/再灌注帶來(lái)的腦損傷。自噬在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的地位極為重要，但是關(guān)

3、于中風(fēng)后自噬是否具有神經(jīng)元保護(hù)作用，大部分的研究都是不確定的或者矛盾的。為了從一個(gè)新的角度去理解自噬在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮的作用，我們采用內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除Atg7的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)外模擬中風(fēng)條件，來(lái)探討內(nèi)皮細(xì)胞自噬對(duì)腦缺血/再灌注損傷的影響和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:
　　1、選取3個(gè)月月齡的血管內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除Atg7的雄性純和鼠（Atg7-/-）和同窩Cre陽(yáng)性的雄性野生鼠(wild type，WT)，經(jīng)心臟灌流取

4、腦，做震蕩切片，免疫熒光染色比較WT鼠與Atg7-/-鼠腦血管生成情況。
　　2、利用matrigel實(shí)驗(yàn)，比較HBMEC對(duì)照株(negative control，NC)與Atg7干擾株（Sh-Atg7）在不同時(shí)間點(diǎn)的血管生成情況。
　　3、待NC與Sh-Atg7細(xì)胞株長(zhǎng)到90％密度時(shí)，分別用trizol裂解，送mRNA芯片。分析比較二者芯片結(jié)果，尋找與血管生成相關(guān)且表達(dá)發(fā)生顯著改變的因子。
　　4、Real-time

5、 PCR檢測(cè)比較NC和Sh-Atg7中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)情況，以確認(rèn)芯片結(jié)果。
　　5、ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)比較NC和Sh-Atg7分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和VEGF的蛋白量。
　　6、選取3個(gè)月月齡的WT鼠和Atg7-/-鼠，分別提取鼠腦總mRNA，Real-time PCR檢測(cè)比較二者IL-6和VEGF的表達(dá)情況。
　　7、利用matrigel實(shí)驗(yàn)，在不同

6、時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)炎癥介質(zhì)IL-6能否補(bǔ)救Sh-Atg7細(xì)胞株的血管生成障礙。
　　8、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾Atg7后，在生理及應(yīng)激條件下，HBMEC中NF-κB通路p-IKK、p-IKBα及IKBα的表達(dá)情況。
　　9、利用核漿分離實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色技術(shù)和凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)，檢測(cè)p65及HIF-1α的表達(dá)、入核及與DNA結(jié)合情況。
　　10、構(gòu)建并篩選高表達(dá)Atg7的HBMEC細(xì)胞株，Real-ti

7、me PCR檢測(cè)Atg7高表達(dá)是否影響內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平。
　　11、Western blot檢測(cè)p62降解情況，來(lái)確認(rèn)干擾Atg7是否影響內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平。并用自噬的特異性抑制劑3-MA處理正常內(nèi)皮，Real-time PCR檢測(cè)相應(yīng)的炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
　　12、做缺血0.5h的小鼠，再灌注24h后，評(píng)估小鼠神經(jīng)癥狀，用腦切片模具，切成2mm厚，每個(gè)鼠腦5片，然后用2％的TTC染色20min，再換成10％的多

8、聚甲醛浸泡2h，拍照，統(tǒng)計(jì)分析鼠腦梗死大小。
　　13、做缺血0.5h再灌注24h小鼠，將鼠前腦的缺血側(cè)第4-8mm trizol裂解，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR檢測(cè)比較Atg7-/-鼠與WT鼠缺血側(cè)腦的炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
　　14、OGD模型:體外以正常的HBMEC為研究對(duì)象，先氧糖剝奪5h，再進(jìn)行正常培養(yǎng)，以模擬缺血/再灌注損傷。分別將再灌注3h、6h、12h和24h的HBMEC用tr

9、izol裂解，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR檢測(cè)不同再灌注時(shí)間點(diǎn)的炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。其中，0h為沒(méi)進(jìn)行缺血處理的對(duì)照組。
　　結(jié)果:
　　1、Atg7-/-鼠腦皮質(zhì)微血管生成減少。
　　2、與對(duì)照株相比，Atg7干擾株血管生成能力受到抑制。
　　3、與對(duì)照株相比，Atg7干擾株中與血管生成相關(guān)的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的轉(zhuǎn)錄水平顯著低下。
　　4、R

10、eal-time PCR進(jìn)一步證實(shí)芯片結(jié)果。
　　5、干擾Atg7后，HBMEC分泌的IL-6顯著減少。
　　6、血管內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除Atg7后，鼠腦炎癥水平降低。
　　7、IL-6能夠恢復(fù)Sh-Atg7細(xì)胞株的血管生成能力。
　　8、干擾Atg7后，HBMEC中NF-κB通路的IKK活化增強(qiáng)，但I(xiàn)KBα表達(dá)量增加;在應(yīng)激條件下，NF-κB通路活化良好，但I(xiàn)KBα表達(dá)仍然較對(duì)照株多。
　　9、干擾Atg7

11、后，p65及HIF-1α入核減少，且p65與NF-κB探針結(jié)合減少，而HIF-1α分布彌散。
　　10、Atg7高表達(dá)不影響內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平。
　　11、干擾Atg7后，內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平降低。抑制自噬能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄。
　　12、敲除Atg7減少鼠腦缺血/再灌注損傷。
　　13、敲除Atg7減少鼠腦缺血/再灌注24h的炎癥水平。
　　14、不能用OGD模型模擬HBMEC缺血/再灌注后的炎