亞低溫對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷保護(hù)機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：建立大鼠液壓沖擊創(chuàng)傷性腦損傷動物模型，利用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，研究在給予亞低溫（32-35℃）治療條件下腦創(chuàng)傷后的大鼠大腦海馬組織蛋白質(zhì)組表達(dá)變化的情況，尋找亞低溫治療后的特異性生物標(biāo)志蛋白。
　　 方法：選取雄性SD大鼠（300-400g）隨機(jī)分為正常體溫組和亞低溫組，復(fù)制大鼠液壓沖擊腦創(chuàng)傷動物模型。在經(jīng)亞低溫治療后分別將正常體溫組和亞低溫組大鼠處死取大腦海馬組織用來提取蛋白質(zhì)樣品。采用雙向凝膠電泳技術(shù)分析兩組大鼠

2、創(chuàng)傷性腦損傷后海馬組織中蛋白質(zhì)組表達(dá)的變化情況，尋找差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)。再利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析方法鑒定兩組間差異性蛋白質(zhì)。最后采用蛋白質(zhì)印跡法檢驗(yàn)四種目的蛋白來驗(yàn)證雙向凝膠電泳的結(jié)果。
　　 結(jié)果：1.亞低溫治療可以改善創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)：采用神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度評分（Neurological Severitv Scores，NSS）來評估腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能缺陷的嚴(yán)重程度。在腦創(chuàng)

3、傷后早期正常體溫組和亞低溫組大鼠在運(yùn)動、感覺、反射和橫梁平衡試驗(yàn)的測試中所得的評分都很高，創(chuàng)傷后1周內(nèi)神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)，在致傷后第7、14、21、28天兩組的NSS評分都呈逐漸下降趨勢，并且亞低溫組較正常體溫組的NSS評分明顯減低，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 2.蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳的結(jié)果：總共選取六幅雙向凝膠電泳的圖像（3幅正常體溫組，3幅亞低溫組），用PDQuest7.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)的自動探測和量化分析。

4、在正常體溫組檢測到的總蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1238±57，亞低溫組為1187±46。在pI值4-9，相對分子量在15-80kD范圍內(nèi)，正常體溫組和亞低溫組之間有21個蛋白質(zhì)點(diǎn)的強(qiáng)度存在明顯差異。其中有14個蛋白質(zhì)點(diǎn)在亞低溫組中的表達(dá)明顯低于正常體溫組，而其余的7個蛋白質(zhì)點(diǎn)在亞低溫組中表達(dá)明顯高于正常體溫組的表達(dá)。（Fig.7，8）
　　 3.MALDI-TOF-MS鑒定差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)的結(jié)果：在正常體溫組和亞低溫組之間的21個差異性蛋白質(zhì)

5、點(diǎn)中，經(jīng)質(zhì)譜分析法鑒定比16個蛋白質(zhì)點(diǎn)（Fig.13，14），而其余5個屬于未知的蛋白質(zhì)點(diǎn)，被鑒定出來的16個蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為熱休克蛋白70（heat shock protein70，Hsp70）、谷氨酸脫氫酶1（glutamate dehydrogenase1）、組織型纖維蛋白溶嗨原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA）、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（glial fibrillary acidic p

6、rotein，GFAP）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase）、磷酸甘油酸變位酶-1（phosphoglycerate mutase-1）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase）、熱休克蛋白27（heat shock protein27，Hsp27）、三磷酸腺苷合酶D鏈（triosephosphate iso

7、merase D chain）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、前載脂蛋白A-Ⅰ（ApolipoproteinA-Ⅰ precursor，pre-ApoA-Ⅰ）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶omega1（glutathione S-transferase omega1，GST omega1）、神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β（glia maturation factor-β，GMF-β）、超氧化合物歧化酶[Cu-Zn]（superoxide

8、 dismutase[Cu-Zn]，SOD[Cu-Zn]）和脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP）（Table-1）。這些被鑒定出來的16種蛋白質(zhì)分別參與細(xì)胞的新陳代謝、應(yīng)激、再生等過程。
　　 4.蛋白質(zhì)印跡法對四種目的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析的結(jié)果：對于蛋白質(zhì)表達(dá)定量水平的測定是通過蛋白質(zhì)印跡方法測得的。在腦外傷后的大鼠海馬組織中我們選擇了四個目的蛋白質(zhì)，包括熱休克蛋白70，神經(jīng)膠質(zhì)酸性

9、蛋白，前載脂蛋白A-Ⅰ和神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β。與正常體溫組相比亞低溫組中當(dāng)前載脂蛋白A-Ⅰ和神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β上調(diào)時熱休克蛋白70和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白明顯下調(diào)，并且這四種目的蛋白在經(jīng)亞低溫治療后的變化趨勢與雙向電泳圖像分析后所得的蛋白質(zhì)變化趨勢相一致。
　　 結(jié)論：1.液壓顱腦損傷儀可復(fù)制各種分級的腦損傷動物模型。復(fù)制的動物模型可以用于創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)病理學(xué)和分子機(jī)制的研究。
　　 2.亞低溫治療可以引起大鼠創(chuàng)傷性腦損