顱腦創(chuàng)傷后亞低溫腦保護機制：差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、大量動物實驗及多數(shù)臨床研究結(jié)果表明亞低溫能減輕創(chuàng)傷性腦損傷后病理損害的程度，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，但其保護作用的機制仍未完全明了，一直也是神經(jīng)科學(xué)界研究的重點。其機制研究也由生化、代謝水平深入至分子水平，人們開始從分子水平闡述亞低溫腦保護的作用機制。以往對亞低溫腦保護的機理研究主要是單個蛋白或者基因，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究亞低溫過程中的全部蛋白質(zhì)的變化尚未見報道。本實驗分為三部分： 第一部分：大鼠液壓沖擊腦損傷后亞低溫和常溫模型

2、的建立 目的： 理想的顱腦損傷動物模型是研究顱腦損傷機制及其診療方法的重要基礎(chǔ)平臺。建立亞低溫(mildhypothermia)和常溫(normothermia)條件下液壓沖擊腦損傷動物模型。評估致傷模型的有效性及傷后腦的改變是否符合實驗要求。為深入開展創(chuàng)傷性顱腦損傷的相關(guān)動物實驗研究奠定堅實的基礎(chǔ)。 方法： 1.實驗動物及分組：雄性SD大鼠30只，隨機分為：假手術(shù)組(n=10)；液壓腦損傷常溫組(n=1

3、0)；液壓腦損傷亞低溫組(n=10)。 2.液壓腦損傷動物模型建立及亞低溫的實施：實驗動物2％戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉，固定頭部于動物立體定位儀。頭皮正中切口3cm，剝離骨膜，前囟人字縫尖連線中點偏右4mm顱鉆鉆孔，骨窗直徑4.8mm，暴露完整硬腦膜。顱骨固定螺絲兩枚，置入內(nèi)徑2.6mm打擊管，牙科骨水泥牢固固定后縫合消毒頭皮切口。術(shù)后予氣管插管，股動脈置管，動物用多導(dǎo)生理監(jiān)護儀監(jiān)測動物血壓、心率變化。動物出現(xiàn)夾足反應(yīng)時，用液壓腦損

4、傷打擊儀壓力1.8～2.1atm造成中度腦損傷。手術(shù)過程用溫度計及腦溫儀監(jiān)測肛溫和顳肌溫度。亞低溫組腦損傷后15min將動物置于降溫毯上，30mi內(nèi)腦溫及肛溫降至32℃～33℃，應(yīng)用加熱墊及冰袋維持亞低溫3h。常溫組傷后保持體溫(37±0.5℃)；假手術(shù)組同樣行顱骨鉆孔和埋管處理，但未遭受打擊損傷。 結(jié)果： 結(jié)果顯示，各組大鼠成功建立液壓腦損傷及亞低溫模型，常溫組傷后維持體溫(37±0.5℃)3小時，亞低溫組維持體溫(3

5、2.5±0.5℃)3小時。通過損傷前后表現(xiàn)及病理生理功能的監(jiān)測，證實致傷裝置能導(dǎo)致大鼠致傷后出現(xiàn)明顯的改變，尤其損傷早期各指標(biāo)變化明顯，病理形態(tài)學(xué)顯示中度腦損傷改變。亞低溫過程中大鼠動脈血壓、心率、呼吸等指標(biāo)基本保持正常范圍。 結(jié)論： 上述檢測指標(biāo)顯示該動物模型符合臨床上接受亞低溫治療的顱腦損傷患者的病理學(xué)改變和病理生理特點。我們成功地建立了大鼠常溫和亞低溫顱腦損傷模型，為下一步亞低溫腦保護的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了良好

6、條件。 第二部分：雙相差異凝膠電泳分離-質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)方法建立與優(yōu)化及顱腦創(chuàng)傷與正常大鼠海馬差異蛋白組學(xué)的研究 目的： 建立與優(yōu)化高通量雙相差異凝膠電泳分離-質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立正常和損傷大鼠海馬組織蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳圖譜。應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較正常與顱腦創(chuàng)傷后大鼠海馬組織蛋白質(zhì)表達譜變化，為從蛋白質(zhì)分子水平揭示創(chuàng)傷性腦損傷及修復(fù)機制打下基礎(chǔ)。 方法： 本研究利用液壓沖擊法建立

7、中度腦損傷動物模型，分別采集假手術(shù)組及腦損傷后3小時組大鼠海馬組織標(biāo)本，提取海馬組織總蛋白。然后利用差異熒光雙向凝膠電泳(DIGE)系統(tǒng)分離上述兩組樣品總蛋白質(zhì)，獲得二維的蛋白質(zhì)分離圖譜，應(yīng)用Tvphoon9400激光掃描儀、DeCyder差異分析軟件圖象分析，獲得差異蛋白點的表達信息。選取部分差異表達的蛋白質(zhì)，運用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進行蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜分析，獲得肽分子重量和肽序列標(biāo)簽，應(yīng)

8、用Mascot搜索引擎，檢索NCBInr20070425(4874565sequences；1684337227residues)蛋白庫數(shù)據(jù)庫，鑒定出差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 首先本研究通過對原有雙向凝膠電泳技術(shù)進行優(yōu)化獲得了分辨率和重復(fù)性較好的正常與顱腦創(chuàng)傷后大鼠海馬組織蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜。平均分離1357±57個蛋白點，蛋白點匹配率約為82％。通過DeCyder差異分析軟件分析報告發(fā)現(xiàn)有差異的(Ratio值大于1.2

9、)的差異蛋白質(zhì)考染點15個，其中9個蛋白的表達量上調(diào)，6個蛋白表達量下調(diào)，未發(fā)現(xiàn)明顯的“有或無”的蛋白點。通過對這些蛋白考染點進行質(zhì)譜分析，鑒定出15個蛋白質(zhì)點，其數(shù)據(jù)庫檢索值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中11個蛋白質(zhì)點有PMF可信搜庫結(jié)果及有TOF-TOF可信搜庫結(jié)果。共鑒定出實際差異蛋白數(shù)為11個。其中腦損傷后表達上調(diào)的蛋白質(zhì)7個，下調(diào)的4個。按其功能分為不同種類，分屬于細胞骨架蛋白、介導(dǎo)能量代謝的酶類、參與核酸合成及氧化應(yīng)激

10、反應(yīng)的蛋白質(zhì)、神經(jīng)突觸功能蛋白、細胞內(nèi)信號傳遞蛋白及未知蛋白。所鑒定的差異蛋白中表達上調(diào)的有：沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源物、突觸小體相關(guān)蛋白、二氫嘧啶酶樣蛋白-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、含SDA1域1蛋白、磷酸甘油酸變旋酶1、3-磷酸甘油酸脫氫酶。表達下調(diào)的差異蛋白質(zhì)有：微管蛋白，α2、ATP合成酶，α亞基，同工型1與同工型CRA_d、脂酰輔酶A水解酶、延胡索酸酶。 結(jié)論： 建立和優(yōu)化了大鼠海馬蛋白質(zhì)組分析的差異凝膠雙向電

11、泳(2-DDIGE)及基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)技術(shù)。成功建立了分辨率高、重復(fù)性好的正常和損傷海馬蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜。正常和損傷海馬組織蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)15個差異蛋白質(zhì)點，為進一步篩選與鑒定影響腦損傷和修復(fù)的蛋白質(zhì)，并探究其作用機制打下了基礎(chǔ)。鑒定得到11種差異蛋白質(zhì)。按其功能分屬于細胞骨架蛋白、介導(dǎo)能量代謝的酶及復(fù)合物、參與核酸合成及氧化應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)、神經(jīng)突觸功能蛋白、細胞內(nèi)信號傳遞蛋白及細胞凋亡

12、相關(guān)蛋白。這些差異蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，為TBI發(fā)病機制的闡明提供了新的線索，為TBI的診斷及預(yù)后提供了可供參考的蛋白標(biāo)記物，為TBI的治療干預(yù)措施的研究提供了新作用靶點和療效判定指標(biāo)。 第三部分：顱腦外傷后亞低溫腦保護差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的： 研究亞低溫對液壓腦損傷后大鼠海馬蛋白質(zhì)表達譜變化的影響，試圖篩選出與亞低溫腦保護有關(guān)的蛋白質(zhì)，并對這些蛋白質(zhì)進行分析，為初步揭示低溫腦保護的機理提供可能的研究方向。 方

13、法： 采用側(cè)方液壓沖擊裝置，建立大鼠中度腦損傷模型，亞低溫組(n=3)于傷后維持體溫33±0.5℃持續(xù)3小時，常溫組(n=3)始終維持體溫37±0.3℃。取大鼠海馬組織，通過差異熒光雙向凝膠電泳(DIGE)、分離蛋白，獲得二維的蛋白質(zhì)分離圖譜，應(yīng)用Typhoon9400激光掃描儀、DeCyder差異分析軟件圖象分析，獲得差異蛋白點的表達信息。然后通過膠內(nèi)酶切、抽提酶解肽段、MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析差異的蛋白質(zhì)點。應(yīng)用M

14、ascot搜索引擎，檢索NCBInr20070425(4874565sequences；1684337227residues)蛋白庫數(shù)據(jù)庫，鑒定出差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 通過DIGE差異熒光雙向凝膠電泳及DeCyder5.0(GEHealthcare)軟件分析，總共有約(1289-1382，平均1357)蛋白質(zhì)點，發(fā)現(xiàn)Ratio值大于1.5有差異蛋白質(zhì)考染點17個，未發(fā)現(xiàn)明顯的“有或無”的蛋白點。對17個蛋白質(zhì)考染點進行質(zhì)

15、譜鑒定，鑒定出17個蛋白質(zhì)點，其數(shù)據(jù)庫檢索值具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。14個蛋白質(zhì)點有PMF可信搜庫結(jié)果及有TOF-TOF可信搜庫結(jié)果。共鑒定出14個蛋白質(zhì)，2個為同一種蛋白，實際差異蛋白數(shù)為13個。其中上調(diào)的蛋白質(zhì)10個，下調(diào)的3個。液壓腦損傷后亞低溫組表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有：神經(jīng)微絲，輕鏈多肽、二氫嘧啶酶樣蛋白-2，、含SDA1域蛋白1、突觸蛋白Ⅱ，亞型1、烯醇化酶1，α、預(yù)測蛋白：KRAB(Kruppel-associatedb

16、ox)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白、3-羥基異丁酸脫氫酶、預(yù)測蛋白：硫轉(zhuǎn)移酶k1、突觸體相關(guān)蛋白-25b，(SNAP-25b)。表達下調(diào)的蛋白質(zhì)有：微管蛋白，α2、延胡索酸酶、脂酰輔酶A水解酶、沉默信息調(diào)節(jié)因子2。 結(jié)論： 通過雙向電泳和質(zhì)譜鑒定，鑒定出了13個差異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)既有作用相對明確與亞低溫腦保護作用有關(guān)的蛋白質(zhì)，如細胞骨架相關(guān)蛋白、軸突功能相關(guān)蛋白、參與細胞能量代謝的酶等，為亞低溫腦保護的機理研究及臨床應(yīng)用提供了依據(jù)

17、。在實驗中我們也發(fā)現(xiàn)一些在亞低溫腦保護中未有過報道的未知蛋白，他們在低溫腦保護中的具體作用可以進行進一步的研究，從而徹底揭示亞低溫腦保護的機理。 總之，本研究利用DIGE及MS質(zhì)譜技術(shù)對顱腦損傷亞低溫和常溫大鼠海馬蛋白質(zhì)進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，獲得了較滿意的雙向電泳圖譜，并用專業(yè)分析軟件包對2-DE圖譜進行了分析，差異蛋白質(zhì)點經(jīng)MALDI-TOF-MS測定肽質(zhì)量指紋圖譜進行鑒定，尋找出了差異蛋白質(zhì)。然后對這些蛋白質(zhì)進行分析，從整