深低溫對全腦缺血性損傷保護機制的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、大量動物實驗及臨床試驗均證實低溫能減輕腦損傷后病理損害的程度,促進神經(jīng)功能恢復(fù),但其保護作用的機制仍未完全明了,一直也是科學(xué)界研究的重點.其機制研究也由生化、代謝水平深入至分子水平,人們開始從分子水平闡述深低溫腦保護的作用機制.以往對深低溫腦保護的機理研究主要是單個蛋白或者基因,利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究深低溫過程中的全部蛋白質(zhì)的變化尚未見報道.因此對于深低溫神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜改變的研究非常必要. 本實驗分為兩部分:第一部

2、分:大鼠深低溫和常溫停循環(huán)全腦缺血模型的建立;第二部分:深低溫和常溫全腦缺血大鼠海馬差異蛋白組學(xué)的研究. 第一部分大鼠深低溫和常溫停循環(huán)全腦缺血模型的建立 目的：建立:DHCA(deep hypothermia circulatory arrest,深低溫停循環(huán))和常溫停循環(huán)全腦缺血動物模型. 方法：實驗分成兩組,深低溫缺血組和常溫缺血組(對照組).取實驗鼠,用3﹪戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定,氣管插管接呼吸機,

3、左腹壁淺動脈插管連接監(jiān)測設(shè)備.然后首先建立CPB(cardiopulmonarybypass,體外循環(huán)),CPB主要由靜脈引流管、貯血器、恒流蠕動泵、膜式氧合器及動脈輸注管組成;CPB采用股動脈灌注、右頸靜脈腔房引流;體外循環(huán)開始后,用熱交換器及體外置冰屑等方法降溫.當(dāng)肛溫降至18℃時停循環(huán),5min后處死動物,取海馬組織.對照組去除降溫步驟,停循環(huán)5min后處死動物,取海馬組織. 結(jié)果：6只大鼠順利建CPB.肛溫達(dá)18℃時停止

4、降溫,降溫時間(肛溫從常溫降到18℃)大約8.0±0.5min.CPB期間在降溫的過程中,分別在33℃、28℃、25℃、22℃、18℃時記錄各項監(jiān)測指標(biāo),并且抽取大鼠外周血及頸內(nèi)靜脈血,檢測血氣分析及電解質(zhì)等的變化.結(jié)果顯示,降溫過程中大鼠動脈血壓、心率指標(biāo)基本保持正常.血氣分析及電解質(zhì)等指標(biāo)基本保持平穩(wěn). 結(jié)論：成功地建立了大鼠DHCA和常溫停循環(huán)模型,為下一步深低溫腦保護的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了良好條件. 第二部分

5、深低溫和常溫停循環(huán)全腦缺血大鼠海馬的差異蛋白組學(xué)研究 目的：應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究深低溫停循環(huán)和常溫停循環(huán)全腦缺血大鼠海馬組織蛋白質(zhì)的變化. 方法：通過建立的深低溫停循環(huán)和常溫停循環(huán)模型,取大鼠海馬組織,通過雙向凝膠電泳、分離蛋白,所得圖譜借助圖像分析軟件lmageMaster 2D Elite進行詳細(xì)分析,比較蛋白斑點差異,然后通過膠內(nèi)酶切、生物質(zhì)譜分析差異的蛋白質(zhì)點,鑒定出深低溫過程中變化的蛋白質(zhì). 結(jié)

6、果：首先利用雙向電泳技術(shù)對大鼠海馬蛋白質(zhì)進行分離,獲得了較滿意的雙向電泳圖譜.通過ImageMaster軟件分析報告發(fā)現(xiàn)有差異的(Ratio值大于1.5)的蛋白考染點14個.通過對這些蛋白考染點進行質(zhì)譜分析,12個蛋白質(zhì)考染點有實際意義.鑒定出32個蛋白質(zhì),其中3個蛋白質(zhì)重復(fù),實際的蛋白數(shù)為29個.深低溫停循環(huán)組和常溫停循環(huán)組比較,僅有少數(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)有顯著性差異,這些蛋白依其功能分為不同種類:細(xì)胞骨架蛋白、介導(dǎo)代謝的酶類、參與信號傳導(dǎo)

7、、參與核酸合成、參與蛋白代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)運輸、功能未知等.其中上調(diào)的蛋白質(zhì)18個,下調(diào)的11個.肌絲蛋白、胞質(zhì)蛋白1、微管蛋白α-1蛋白、微管蛋白β鏈、微管蛋白β-5鏈、特殊Ⅲ級神經(jīng)元β微管蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前體蛋白等細(xì)胞骨架蛋白呈上調(diào)趨勢,熱休克蛋白、蛋白酶體呈上調(diào)趨勢,二磷酸果糖酶、酪氨酸磷酸酯酶、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白等與代謝有關(guān)的酶類呈下調(diào)趨勢,蛋白激酶C、神經(jīng)蛋白1蛋白激酶基質(zhì)呈下調(diào)趨勢. 結(jié)論：通過雙向電泳和質(zhì)譜鑒

8、定,鑒定出了29個差異蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)既有我們在文獻中已經(jīng)報道過的與深低溫腦保護作用有關(guān)的蛋白質(zhì),如肌絲蛋白、胞質(zhì)蛋白1、微管蛋白α-1蛋白、微管蛋白β鏈、微管蛋白β-5鏈、特殊III級神經(jīng)元β微管蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前體蛋白等細(xì)胞骨架蛋白、熱休克蛋白、蛋白酶體,他們在腦保護作用中的作用機理已被大量的實驗證實.通過我們對它們的分析,我們從整體上對深低溫腦保護的具體機制有了宏觀理解.同時我們也發(fā)現(xiàn)一些在深低溫腦保護中未有過報道的未知蛋白,它們的

9、具體作用還有待于進一步的研究.全腦缺血后深低溫差異蛋白圖譜中顯示的多個蛋白的表達(dá)變化說明深低溫下神經(jīng)細(xì)胞的變化是非常復(fù)雜的,全腦缺血后深低溫差異蛋白圖譜中顯示的多個蛋白的表達(dá)變化說明深低溫下神經(jīng)細(xì)胞的變化是非常復(fù)雜的,深低溫對腦組織的保護作用是肌絲蛋白等細(xì)胞骨架蛋白、熱休克蛋白、蛋白酶體、二磷酸果糖酶等與代謝有關(guān)的酶類、蛋白激酶C等共同作用的結(jié)果,對深低溫腦保護的具體作用機制我們要進行全面分析及研究. 總之,本研究通過建立的深低